流式细胞分析方案课件

1、流式细胞仪（流式细胞仪（FlowCytometer简称简称FCM）是一项集激光）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术及细胞技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器的问世的技术。从开始设想到第一台仪器的问世,科技工作者进行科技工作者进行了

2、不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，了不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具。经成为日益完善的细胞分析和分选的工具。BD FACSVantageBD-Calibur 其特点是：其特点是：测量速度快，最快可在测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；秒种内计测数万个细胞；可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、

3、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；领域的知识和成果；既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系

4、统；光路系统以及电系统。其作用如下：流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： 液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。光照射区。 光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。产生光信号，并传送到相应的探测器。 电系统：把光信号转换为电信号。电系统：把光信号转换为电信号。在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作

5、中，用实体组织进行流都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。散

6、射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 Flow CellInjector TipSheath fluid 高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。据。 低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用胞受激光照射的能量比较均一

7、，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。分析。 前向角散射：前向角散射（前向角散射：前向角散射（FSC）光与被测细光与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号。散射光信号。FSC不受细胞荧光染色的影响，不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。常用于免疫表型分析的信号处理。Forward Angle Light Scatter前向角前向角FALS SensorLaser侧向角散射：侧向角散射（侧向角散射：

8、侧向角散射（SSC）光与光与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感。感。SSC收集与激光束正交收集与激光束正交90度方向的度方向的散射光信号。散射光信号。90 Degree Light Scatter90度侧向角度侧向角FALS Sensor90LS SensorLaser颗粒度细胞大小上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图群，同时可获得

9、细胞相关的重要信息，下图（图（图3-2）为）为FSC和和SSC组成的二维散点图，组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开核细胞及粒细胞区分开。 荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换称为荧光。称为荧光。 能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的能量消耗在吸

10、收转换而不是荧光转换中，为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。发射波长范围叫做发射光谱。 目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光。光的激光器能够激发一种以上的荧光。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图的激发光谱如图3-3所示，所示， 488nm非常接近非常接近FITC的激发光谱的的

11、激发光谱的峰值，所以峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信被激发时会表现出最强荧光信号，而当号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。Fluorescein (FITC)400 nm600 nm700 nmRelative IntensityWavelength500 nmExcitationEmissionPhycoerythrin (PE)400 nm600 nm700 nmRelative IntensityWavelengthExcitationEmission500

12、 nmFluorescent Dyes600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser Lines对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记面抗原标记确认细胞类型。在细胞的混合群体中，我们使确认细胞类型。在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的染色模式与染色模式与FSC和和SSC数据相结合，用于识别样数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。

13、而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。分选。FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detectorPMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersExample Channel Layout for Laser-based Flow CytometryLaser 1234Flow cell台式机通常配有两根激光器：第一根激光台式机通常配有两根激光器：第一根激光器波长为器波长为488nm。第二根为波长。第二根为波长635nm的红二极管固态激光器。的红二极管固态激光器。n设门设门

14、n通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据球细胞，可根据FSC或细胞大小，在或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。细胞亚群的荧光特性。直方图可直观单个参数的细胞数量。阴直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右性对照用于决定直方图中单参数的左右边界。左图中边界。左图中M1为阴性对照峰。右图中为阴性对照峰。右图中M2为为CD3 FITC阳性峰。阳性峰。 统计

15、结果表明，整个事件共记录了统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内个细胞，门内淋巴细胞淋巴细胞2891个。其中个。其中M1（阴性）细胞阴性）细胞619个，个，M2（CD3阳性）细胞阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳阳性 百 分 含 量 的 统 计 结 果 为 ：性 百 分 含 量 的 统 计 结 果 为 ： M 2 ：2272/2891=78.59%。 二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图为二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以阴性对照图，用于设定阴性对照边界，

16、全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为为双阴性细胞，左上象限（双阴性细胞，左上象限（UL）为为Y轴阳性细胞（轴阳性细胞（CD19 PE），），右右下象限（下象限（LR）为为X轴阳性细胞（轴阳性细胞（CD3 FITC），），右上象限右上象限（URUR）为双阳性细胞（为双阳性细胞（CD19CD19+ +/CD3/CD3+ +）。）。 如图如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（ C D 1 9+/ C D3 +） 的 百 分 含 量 为 ：的 百 分 含 量 为 ：296/283

17、9=10.43%。 488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detectorPurdue University Cytometry Laboratories流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用临床常见应用临床常见应用微转移肿瘤细胞微转移肿瘤细胞灵敏度:10-7 细胞周期分析细胞周期分析: :在细胞周期在细胞周期( (G0G0，G1G1，S S，G2 G2 ，M)M)的各个时期，的各个时期，DNADNA的含量随各时相呈现的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸

18、染料标记出周期性的变化。通过核酸染料标记DNADNA，并并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出期的分布状态，计算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（利用细胞周期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖核增殖抗原（抗原（PCNAPCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：等，对细胞周期进行精确的分期：G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M.DNA含量及细胞周期分析含量及细胞周期分析0 200 400 600 8001000DNA co