PCR技术及重组DNA技术

1、一、PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点PCRPCR反应标准体系反应标准体系模板DNA 0. .12ug4种dNTP混合物 各200umol/L特异性引物 各10100pmolDNA聚合酶 2. .5uPCR缓冲液：Tris-Hcl 10mmoL/L Kcl 50mmol/L Mg2+ 1. .5mmol/L 乙酰BSA 0.1mg/mlPCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺

2、旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍MOVIEPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点第1轮结束9

3、5第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417（1）在250ul PCR管内配置25ul反应体系： CK(ul)1#(ul)模板02引物10.50.5引物20.50.5

4、10 PCR Buffer2.52.5Taq酶0.30.3dNTPs2.02.0ddH2O19.217.2Total2525（2）PCR反应程序PCR结果：1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点n灵敏度高n皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平n能从100万个细胞中检出一个靶细胞n病毒检测的灵敏度可达3个RFUn细菌检测的最小检出率为3个细菌n简便、快速n一次性加好反应液，14 小时完成扩增n扩增产物一般用电泳分析n对标本的纯度要求低1.血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNALambda

5、DNA，模板量分别为100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10fg n序列的查找可在相关的网址，如/pubmed查找各种目的序列。n同源性比较可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较或通过OMIGA等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对引物设计常用软件主要有：nPrimer Premier 5.0 nOligo 6nprimer 3nThe Primer GeneratornNet Primer 1. 将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法 在对话框中输入待扩增序列 点击左上角

6、的“Primer”按钮2. 设置相关参数3. 得到的引物结果Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构引物自身是否会形成发夹结构Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体同一种引物是否会形成二聚体False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对引物在待扩增序列中其他位置是否有配对Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和正向和反向引反向引物的互物的互换换正向和反向正向和反向引物的评价引物的评价正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每点击左每点击左边红色的边红色的按钮，就按钮，就出现相应出现相应的内容的内容对正向和反向

7、引物进行编辑对正向和反向引物进行编辑可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基引物的信息引物的信息改动后引物的信息重新回到双引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 34. 输出引物序列n引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC 纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 普通PCR：OPC纯（95%） 较长引物（大于50个碱基） ：PAGE纯（95%） 经过修饰或标记的引物：HPLC纯（ 99%,但价格昂贵）n引物浓度：0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 ：n

8、95的半寿期为40min n最适温度（72）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸 n酶活性（受多种因素影响）：53方向的聚合酶活性，53方向的外切酶活性和逆转录酶活性，非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3端突出一个单A核苷酸尾 nPfu DNA聚合酶 ：具有35外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于2kb的片断扩增。nVent DNA聚合酶：又称Tli DNA聚合酶，该酶耐高温且具有3-5外切酶活性的校对功能，其保真性较Taq DNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（12kb）的功能较强。思考题： 重组重组DN

9、ADNA技术的技术的概念概念重组重组DNADNA技术的技术的基本条件基本条件 工具酶工具酶 目的基因目的基因 运载体运载体用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程举例说明举例说明主要内容：主要内容：是在体外体外将不同来源的特异基因或特异基因或DNADNA片段片段插入病毒、质粒或其它载体载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆。DNADNA

10、克隆克隆一、重组一、重组DNADNA技术概念技术概念二、重组二、重组DNADNA技术的基本条件技术的基本条件n（一）工具酶（一）工具酶n（二）目的基因（二）目的基因n（三）运载体（三）运载体n（四）用于基因转移的受体菌或细胞（四）用于基因转移的受体菌或细胞（一）重要的工具酶（一）重要的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切

11、酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于c

12、DNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是识别限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类

13、内的一类内切酶。切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定义：定义：型限制性核酸内切酶的作用特点型限制性核酸内切酶的作用特点 回文结构回文结构 大部分型限制酶能够识别由4个8个核苷酸组成的特定序列。型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（如图）。“回文”意为顺读和倒读都一样的。切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口2.DNA2.DNA连接酶连接酶( (基因工程的基因工程的“缝纫针缝纫针”) ) （1）T4噬菌体DNA连

14、接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导。（2）大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接 。3.DNA3.DNA聚合酶聚合酶（1）Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80），分子量65kD,也具5和3外切酶活性。（2）反转录酶(RDDP):多功能酶，无3和5DNA外切酶活性，具有3和5RNA外切酶活性。n进行进行DNADNA重组的目的主要有两方面：重组的目的主要有两方面： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得

15、感兴趣基因的表达产物（蛋白质）这些使我们感兴趣的基因或使我们感兴趣的基因或DNADNA序列序列就是目的基因。（二）目的基因（二）目的基因（二）目的基因（二）目的基因1. 1.表达载体表达载体: :为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列可转录翻译成多肽链序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为而特意设计的载体称为表达载体表达载体。2. 2.克隆载体克隆载体: :为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列被扩增而特意设计的序列被扩增而特意设计的载体称为载体称为克隆载体克隆载体。（三）运载体（三）运载体（三）运载体（三）运载体运载体应具备的条件：运载体应具备的条件：n具有针对受体细胞的亲缘

16、性或亲和性（可转移性）n具有与特定受体细胞相适应的复制点或整合位点n具有较高的外源DNA的载装能力n具有多种单一一的核酸内切酶识别切割位点n具有合适的筛选标记（四）用于基因转移的受体菌或细胞（四）用于基因转移的受体菌或细胞常用受体类型：常用受体类型： 大肠杆菌：背景清楚，生长迅速，培养简单等，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。 酵母菌：具有真核生物特性，背景清楚，生长迅速，培养简单，遗传稳定，可用于基因的克隆，表达，基因文库的构建等，是DNA重组实验和基因工程的重要的真核性受体菌。 哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）：与人的亲缘关系近，分子表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统；细胞

17、培养条件苛刻，生长缓慢；适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究，是DNA重组实验和基因工程的主要的哺乳动物受体。三、重组三、重组DNA技术的基本过程技术的基本过程 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA

18、目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目的基因的获取和体外重组目的基因的获取和体外重组n化学合成法：化学合成法：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨要求：

19、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基酸序列。n基因组基因组DNADNA文库文库ncDNAcDNA文库文库n聚合酶链反应聚合酶链反应一一.目的基因的获取目的基因的获取: 外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接: :体外重组体外重组方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 粘性末端连接粘性末端连接DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程。连接方式:（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）同聚物加尾连接（四）人工接头连接（五）T-A克隆B

20、am H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶16CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位

21、点的连接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶16C重组体重组体 平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DN

22、A连接酶连接酶16C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连在末端转移酶的作用下，在在末端转移酶的作用下，在DNA片段末片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。行粘端连接。 同聚物加尾连接同聚物加尾连接DNA连接酶同聚物尾巴同聚物加尾法连接重组DNA分子 由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头人工接头(linker)连接连接利用人工合成的接头连接重组DNA分子5.T-A克隆克隆nT-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载

23、体中的方法。(一)、重组、重组DNA分子的导入分子的导入重组重组DNA分子的导入和筛选与鉴定分子的导入和筛选与鉴定常用的导入方法常用的导入方法: : （一）转化（二）转染一）转化方法一）转化方法1. 1.氯化钙法：氯化钙法：细菌处于低温、细菌处于低温、低渗低渗CaCl2CaCl2溶液中，菌细胞壁溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组形，经短暂热休克后重组DNADNA易进入易进入2. 2.电穿孔法：电穿孔法：除特殊仪器外除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、注意电场强度、电脉冲长度、DNADNA浓度等

24、参数。浓度等参数。50-100mmol/LCaCl2 二）转染二）转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程n方法：方法：n磷酸钙转染磷酸钙转染n DEAEDEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染n 电穿电穿孔孔 : :操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。n 脂质体转染脂质体转染 : :脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。n 显微注射显微注射: :转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于稳定表达(

25、一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1根据载体的抗药性标记筛选 2根据载体的抗药性标记插入失活选择 3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选 4根据插入的外源基因性状进行筛选 （二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法 (六) DNA序列检测(二)、重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定AmprTetrBamH位点BamH酶切BamH酶切DNA连接酶目的DNA重组质粒大肠杆菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板四、举例说明四、举例说明 (一)引物的设计及合成n根据本实验室已经完成全基因序列测定的豹源FCV 的ORF2 序列设计引物，选择的酶切位点为EocR I/Xho I，扩增目的片段长度为1 734 bp。n上游引物序列：CCGGAATTCCGGATGTGCTCAACCTGCGCTAA；n下游引物序列：CCGCTCGAGGTTAATGACATAGCCCAATTTTAGTGTG；n引物送往生工生物工程上海股份有限公司合成。 （二）目的基因片段的扩增n以本实验室保存的含有豹源FCV ORF2的质粒为模版，用高保真ExTaqDNA聚合酶进行目的基因的扩增。n扩增体系为：模板2L、dNTPs 2L，PCR 缓冲液2.5L，上、下游引物各0.5L，ExTaq DNA聚合酶0.3L，双蒸馏水17.2L。n反应条件：