y集本科罗丹丹学士学位

1、罗丹丹学士目录目录摘要1缩 写 表3文献综述4以肿瘤为靶的抗体导向治疗的研究进展4参考文献18实验研究工作251引言252实验材料与主要仪器263实验方法274实验结果与讨论4.1 女性生殖系统肿瘤的不同阶段中抗体 A 与的结合294.2 抗体 A 在肝癌组织与正常肝脏组织中的差异314.3 正常及成人组织中抗体 A 的检测31致谢36罗丹丹学士摘要摘要肿瘤的生长和转移依赖于生成。新生毛细生成是指从已存的不同于正常组织通过或形成新生毛细，其更新周期为几天，而正常组织则通常是几百天。新生内皮，如治疗细胞上表达了一些处于静止期内皮上所没有或低表达的整和素avb3、内皮素、E-selectin 等,

2、这些可以作为抗肿瘤的靶位点。封闭其功能，可抑制内皮细胞的生长、迁移或浸润，从而高效地破坏新生的形成，达到抗肿瘤的目的。抑制肿瘤生成是一种肿瘤治疗的新策略。它是通过损伤肿瘤，阻断其营养和氧的供应，从而使肿瘤细胞缺血坏死。这种“”肿瘤疗法与常规的肿瘤化疗和放疗以及肿瘤细胞靶向治疗相比，具有以下特点：不易产生耐药性；具有广谱抗肿瘤作用；具有放大作用，疗效高；肿瘤直接作用于内皮，无需渗透和分布穿透到肿瘤深部，避免了肿瘤组织局部高压所引起的问题；特异肿瘤，而不损伤正常。因此，抗肿瘤生成疗法既具有化疗的广谱性，又避免了化疗由于缺乏肿瘤专一性和易产生耐药性所带来的临床问题，是一种极有前景的肿瘤治疗方法。我们

3、模仿体内肿瘤内皮细胞生长状态，用经肝癌细胞培养上清刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)免疫小鼠，了一株肿瘤新生特异的鼠单克隆抗体 A。鼠单克隆抗体 A 是一株新型抗肿瘤生成抗体，体外、体内实验均表现良好的抗生成和抗肿瘤生长的活性。本的组织分布、细胞不同于国内外已前期工作已分析研究了抗体 A 所对应的抗原及理化性质鉴定。实验结果表明抗体 A 靶的肿瘤新生内皮细胞标志物，抗体 A 很可能是一种新型的抗肿瘤抗体。在此基础上，我们进行了大量肿瘤实验，发现抗体 A 与 20 多种人肿瘤组织中的特异结合，而且不结1罗丹丹学士摘要合绝大多数肿瘤及正常组织。本实验主要包括：1采用免疫组化方法检测抗体 A 在生

4、殖系统（乳腺、）肿瘤组织的不同阶段中对的结合。随着肿瘤程度的加深，抗体 A 的结合量增加，说明随着肿瘤的生长，新生不断增多，该抗体与新生结合，成为肿瘤诊断的依据之一。采用免疫组化方法检测抗体 A 在肝癌组织与正常肝脏组织中结合的差异。显微镜下可明显观察到抗体 A 在肿瘤组织2中比在正常组织中结合的数量多，密度大，可根据数目来说明抗体 A 在肝癌组织中的特异单个视野中的结合。3采用免疫组化方法检测的抗体 A 与及成人（男、女）正常组织中与的结合情况。结果显示大多数正常组织中均能检测得到对应抗原的表达，有个别组织例外。由于存在之间的差异以及组织之间的差异，所以还需要进行大量的体内、体外实验来进一步

5、研究抗体 A 及其靶抗原的性质和分布，以及在生成中的作用。2罗丹丹学士缩写表缩 写 表Ab aFGF抗体（antibody）酸性成factor） 碱性成factor）细胞生长因子（acid fibroblast growthbFGF细胞生长因子（basic fibroblast growthcDNA DAB ECFab FLK-1 FLT-1GM-CSF互补 DNA（complementary DNA） 二氨基联苯胺（diaminobenzidine） 内皮细胞（endothelial cell）抗原结合段（antigen-binding fragment）胎肝激酶-1（fliver kina

6、se-1）fms 型酪氨酸激酶-1（fms-like tyrosine kinase-1） 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor） 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell）胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor） 白细胞介素（interleukin）干扰素诱导蛋白 10（interferon-i

7、nducible protein 10）单克隆抗体（monoclonal antibody）磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline）血小板衍生内皮生长因子（platelet derived endothelial cell growth factor）血小板衍生生长因子（platelet-derived growth dactor） 血小板因子-4（platelet factor-4）胎盘生长因子（Placenta growth factor） 单链抗体（single-chain fragment variable）转化生长因子（transforming growth

8、 factor） 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor）血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1）内皮生长因子（vascular endothelial growth factor）HGF HRP HUVECIGF ILIP-10MAb PBSPD-ECGFPDGF PF-4 PIGFScFv TGF TNF TSP-1 VEGF3罗丹丹学士文献综述文献综述第一部分肿瘤生成的调控机制及生成抑制剂的研究进展由正常细胞演变而来的实体瘤细胞具备正常细胞所不具有的两个独特性能：一是增生；二是产生赖以增生的体内环境。而诱发生成能力是这种“内环境”的重要组成部分。没有新生形

9、的增生能力，也不能在体内形成肿瘤1。成，即便细胞具备的形成包括两种不同的方式建成 (vasculogenesis)和生成(angiogenesis）。前者是指在胚胎发生期，由中胚层的成血管细胞发育成初级的。后者是指已有通过出芽或的方式形成新的网2。成年后的新形成主要是生成，即已有的分化了的内皮增殖、迁移形成新的。生理状态下的生成发生于女性周期 (、胚胎植入、妊娠）、胚胎发育、器官形成、毛发生长、伤口愈合、炎症反应、组织再生和重建，这些都25罗丹丹学士文献综述是局限于一定程度、区间和期间而且受到严格的非病理过程。许多疾病如视网膜病变、关节炎、银屑病、瘤、肿瘤都伴随着异常的生成。在这些病理状态下，

10、生成是失控的，持续时间长，而且一般自动回到静止状态。一正常和肿瘤生成目前对生成的具体过程已有了较明确的认识3、4：在局部促生成因素的刺激下，毛细的内皮细胞被激活，形成了血管生成表型，即内皮细胞生成的遗传信息进行表达的过程。进而引起局部扩张、通透性增加，细胞连接松弛，各种蛋白酶的表达明显上调，基底膜及细胞外基质发生降解，形成间隙。同时，激活的内皮细胞的各种细胞器数目和大小有了明显的增加，胞质突起形成伪足，在细胞外基质中进行并逐渐向外迁移，在迁移的前沿，内皮细胞不断地增殖和分化；在其后缘，内皮细胞则改变形状形成紧密连接的组织结构，形成毛细芽。相邻的毛细芽融合形成新生袢。成最后阶段也叫做“塑型”，主

11、要包括壁细胞(周细胞或平滑肌细胞）对的包围、基底膜的产生、或床特化的诱发。目前已知的管腔的形成和适时的基底膜沉积机制主要有5：非极性的内皮细胞内小泡融合或细胞体弯曲而形成腔，继而基底膜26罗丹丹学士文献综述沉积；移出的有极性的内皮细胞立即形成的裂隙状腔，以及伴随细胞移行的基底膜沉积；在大形成跨腔的桥又称为套叠式生长(intussusceptive growth)过程分隔。创伤愈合过程中，可见壁细胞对毛细的包围与生长的停止有关，提示周细胞进入增殖中的毛细的基底膜可能是生长抑制的机理。临床观察也支持壁细胞在稳定中的作用，如糖尿病视网膜病增生的缺乏壁细胞，而给未成熟引来周细胞则可以可使转向成熟5。周

12、细胞的转化生长因子b (transforminggrowth factor-b,TGF-b）的活化是稳定新生结构的重要因素，TGF-b可抑制内皮细胞的增生、迁移同时刺激周细胞、平滑肌细胞的增殖和分化。所以，壁细胞的包围才能使样结为稳定的、成床6。简言之，生成的过程包括微内皮细胞的游走和增殖、蛋白水解酶的激活和消化、细胞外基质的破坏和重建以及内皮细胞管状的形成。肿瘤生成与生理条件下的生成有很多相似之处，但也有一定的差异，主要表现为无控性和未成熟性7、8、9、10。在结构方面，肿瘤管壁薄、分化差，管腔膨胀或呈囊状，具有不正常的分支模式，内皮细胞幼稚，缺乏平滑肌细胞和周细胞的覆盖，基底27罗丹丹学士

13、文献综述膜整呈片段状，周围节缔组织，渗漏性高。在功能方面，肿瘤不具备完整的微循环功能，生成后不再分化或形成相应的小动脉和小静脉，缺乏侧枝环路供应，不具备收缩功能，缺乏神经体液调节和淋巴回流。在分布和构筑方面，肿瘤处于高度无序状态，位于肿瘤中心的稀疏甚至缺如，存在与肿瘤坏死有关的无区；肿瘤外带密集，互相吻袢，为肿瘤增殖侵袭的活跃区。肿瘤的内皮细胞有一些区别于正常内皮细胞的生化和功能特征11、12，例如肿瘤的内皮细胞一旦被激活就变成等13指纺锤状且不再接受周细胞的负调空。最近 Benjamin管与壁细胞之间的形成标志着生长因子依赖性的结束。而肿瘤则陷入一种高水平的生长因子引起和维持的、缺乏周细胞包

14、围的未成熟系统的循环，所以有人将其称之为“不可修复的创伤”，去除生长因子不仅停止了生成，同时也使未成肿瘤解聚。Folkman 等认为，在肿瘤生长过程中存在两个阶段前期 (prevascular phase）和期 (vascular phase），并将两阶段的转化生成切换 (angiogenic switch）14。过程称为前期是指在肿瘤发生的早期，局部几乎无新生形成的阶段。此时肿瘤细胞的增殖率和率相近，肿瘤大小不超过数个立方毫米，生长速率缓慢，呈线性，也很少发生转移。期的特点是肿瘤局部有大量的新生28罗丹丹学士文献综述形成，肿瘤呈指数性生长，并向周围组织浸润。由于新生的基底膜整，通透性高及新生

15、的内皮细胞胶原酶和纤溶酶原激酶，肿瘤细胞极易穿透壁而随血流播散。肿瘤的侵袭转移是一复杂的多阶段过程，可概括为15：瘤增殖、肿瘤新生生长；瘤细胞侵袭基底膜；穿入或淋巴管；在循环系统里存活，形成瘤栓并转运到远隔靶；滞留于靶的微小中；穿管并形成微小转移灶；肿瘤形成，转移癌灶增殖。可见在肿瘤转移的过程中，生成均起着重要的作用。值得注意的是，新生的存在不能用于良、的鉴别，例如肾上腺腺瘤属于良性肿瘤，但却富含。二.肿瘤生成的调控机制与肿瘤生成相关的因子Folkman 等认为，导致肿瘤生成切换的是生成的刺激因子和抑制因子间的平衡被打破，即生成的刺激因子增多和/或抑制因子的减少。由肿瘤细胞、内皮细胞和支持细胞

16、等的各种因子及其相互作用了肿瘤生长的过程。表-1 列出了一些相关因子。29罗丹丹学士文献综述表-1内源性生成相关因子生成刺激因子内皮生长因子/通透因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF/vasculapermeability factor, VPF）酸性和碱性成细胞生长因子（ Acidic and basic fibroblast growth factoaFGF&bFGF）肿瘤坏死因子a、b（Tumor necrosis factor-a&b, TNF-a&b） 转化生长因子a、b (Transforming growt

17、h factor-a&b, TGF-a&b)血小板源性内皮生长因子(Platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor, PDGF） 胎盘生长因子(Placental growth factor, PIGF)肝细胞生长因子/扩散因子(Hepatocyte growth factor/scatter factor, HDF/SF)白细胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)生成素（Angiogenin）生成因子-1(Angiop

18、oietin-1) 增殖蛋白(Proliferin)生成抑制因子内皮抑素(Endostatin) 抑素(Angiostatin)白细胞介素-12(Interleukin-8, IL-12)生成因子-2(Angiopoietin-2)30罗丹丹学士文献综述血小板因子-4(Platelet factor-4, PF-4)血小板反应蛋白 1，2(Thrombospondin-1&2, TSP-1&2)肿瘤坏死因子a（Tumor necrosis factor-a, TNF-a） 转化生长因子b (Transforming growth factor-b, TGF-b) 干扰素-a、b

19、(Interferon-a&b)催乳素片 16kDa 段(Prolactin fragment)干扰素诱导蛋白-10(Interferon-inducible protein-10, IP-10)金属反应蛋白(Mlospondins, METH-1&2)1.生成刺激因子内皮生长因子/通透因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF/vascular permeability factor, VPF）VEGF 是一种双链蛋白，内皮细胞特异的有丝原，在肿瘤生成中起着的调节作用。VEGF共有 8 个外显子，通过不同的 mRNA，可以形成以同源二

20、聚体形式存在的 5 种不同VEGF。每个单体分别为 121，145，165，189，206 个氨基酸。这 5种 VEGF 均含有外显子 15，8 编码的氨基酸，其中由 15 外显子编码的功能区是 VEGF 与其受体结合的识别位点。而 6，7 外显子的不同导致了 5 种 VEGF 与肝素以及硫酸乙酰肝素的结合能力的显著不同16。31罗丹丹学士文献综述VEGF 具有增加微的通透性、促进不同来源的内皮细胞的、增殖和迁移、促进构建等多种作用，是已知的最强的血管通透剂。VEGF 选择性地作用于内皮细胞膜上地两种型酪氨酸激酶受体 flt-1 和 KDR/flk-1，通过磷酸肌醇特异性磷脂酶 C 使胞内IP

21、3 浓度升高而发挥作用。实验显示：VEGF 与 KDR 结合通过活化蛋白激酶 MAPK，促进内皮细胞增殖。而 VEGF 与 flt-1 结合不能促进内皮细胞增生，但能诱导产生大量地蛋白酶，这对于破坏基底膜，触发形成是非常重要的15。缺氧和低血糖都能增加 VEGF 的表达。VEGF 能诱导上窗孔和囊状空泡的形成，使生成所需蛋白借助此通道渗出，导致了外蛋白凝胶的形成，提供了内皮细胞和肿瘤细胞生长的基质 17。最近还发现 VEGF 能维持内皮细胞的存活，并与诱导 bcl-2 基因的表达有关18、19，bcl-2编码一种抗凋亡蛋白。成细胞生长因子(fibroblast growth factor, F

22、GF)目前已知 FGF共有 9 个成员，其中最重要的是酸性成纤维生长因子(aFGF)和碱性成生长因子(bFGF),二者都属于肝素高亲和的生长因子类,其中 bFGF 与生成关系较为密切。它们在正常生理条件下，参与了对细胞生长、分化，胚胎发育和生成的调节。FGF 的受体包括 4 种同源的酪氨酸激酶受体，这些受体胞外均具有 332罗丹丹学士文献综述个免疫球蛋白样功能区可与 FGF 结合，一个跨膜区和具有酪氨酸激酶的胞内区20。bFGF 是内皮细胞的强促剂和趋化因子，具有促生成作用，可直接刺激内皮细胞的增生和蛋白酶的，并能调节内皮细胞表面整合素(integrin）的表达，促进内皮细胞的迁移21。实验证

23、明：在一些大型肿瘤组织，阻断 VEGF 的信号传导并不能抑制肿瘤的生长，而 bFGF 则能替代 VEGF 的作用22。bFGF 和 FGFR 在许多肿瘤组织种均有表达，bFGF 在肿瘤组织中的表达强度可超过正常组织 10 倍以上，并与肿瘤的分级和微密度 (microvasculardensity, MVD)水平相关23。此外，VEGF 和 bFGF 在体外生成过程中有协同作用，体外 VEGF生成作用以及诱导纤溶酶原激活物（PA）的能力依赖于内皮细胞产生的 bFGF24。细胞粘附内皮细胞在生成的启动、增殖和成熟阶段必须相互粘附并与细胞外基质粘附，故粘附与生成密切相关。数种整合素表达于内皮细胞的有

24、腔和无腔表面，参与内皮细胞的迁移和生成，其主要识别位点是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽。整合素与其配体的结合使细胞骨架在细胞膜表面的特殊位点聚合，以便细胞运动或维持组织稳定；同时也激活调控细胞或编程性的胞内33罗丹丹学士文献综述通道25。内皮细胞选择素(E-selectin)是一种促进内皮细胞向生长刺激源迁移的粘附糖蛋白，作为内皮细胞和白细胞的粘附特异地表达于内皮细胞膜上，参与毛细管腔的形成26。E-selectin 伴随着增殖内皮而高表达，是生成的一个内皮细胞标记物。血小板内皮细胞粘附-1 (PECAM-1/CD31）是免疫球蛋白超的成员，内皮细胞上的表达参与调节内皮细胞与白细胞、血

25、小板的细胞粘附，通透性改变和生成等过程。CD31 与内皮钙粘素（VE-cadherin）的具体调节机制有待于进一步阐明。其他肿瘤坏死因子(TNF-a)是一种单核巨噬细胞源性的多功能因子。低剂量的 TNF-a诱发生成，而高剂量的 TNF-a则抑制生长27。TNF-a的促生成活性是通过其细胞毒性的炎症机制而实现的。另外，TNF-a还能增加 IL-8、VEGF、bFGF 在基质细胞和肿瘤细胞的表达28。转化生长因子b (TGF-b)是由巨噬细胞和活化的血小板产生，对巨噬细胞起趋化作用，由此具有间接的生成促进作用，与其剂量有关，即低浓度时具有刺激作用，高浓度时起抑制作用，缺乏时血管完整性不良和再塑性降

26、低29。34罗丹丹学士文献综述白细胞介素-8(IL-8)已被证实有诱导肿瘤生成和肿瘤细胞运动的能力。血小板源内皮细胞生长因子（PD-ECGF）是一种神经元的存活因子和胸腺嘧啶核苷的磷酸化酶，由巨噬细胞系统表达，主要见于病理情况下的生成，PD-ECGF 能促进内皮细胞增殖、趋化与肿瘤的侵袭、转移也有关5。2.生成抑制因子抑制素 (angiostatin）angiostatin 是第一个肿瘤源性的肿瘤生成抑制因子，能抑制远离肿瘤的下游位点的生成，保持原位癌的“休眠”状态，阻止转移灶的生长和化30。它是纤溶酶原的一个特异片段，相对分子量是 38kDa，含有 4 个同源的具有 3 对二硫键 Kring

27、le 结构域。angiostatin 特异性抑制内皮细胞的增殖和分化，Kringle 1 和 Kringle 3抑制内皮细胞增殖作用最强，其次为 Kringle 2，而 Kringle 4 对诱导的内皮细胞的增殖无作用，但 Kringle 4 抑制内皮细胞的游走作用最强31。最近的研究显示：angiostatin 可与内皮细胞膜上的 ATP酶的a/b亚结合，造成内皮细胞中 ATP 减少，从而减低内皮细胞对缺氧的耐受力并造成不可逆的损伤32。内皮抑制素(endostatin)endostatin 是型胶原的 C 端胶原区内 184 个氨基酸片段，35罗丹丹学士文献综述它是高活性的内皮细胞特异抑制

28、剂，能引起内皮细胞的凋亡，显著减低bcl-2 和bcl-XL 抗凋亡蛋白的表达33。Endostatin 含有 11 个精氨酸，与肝素有很高的亲和力，其结构相互作用形成一个大的碱性表面，能与 bFGF 竞争结合细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖，阻断 bFGF的信号传导34。Endostatin 和 angiostatin 两者和用有协同作用，能使肿瘤完全消退并在治疗后不再复发。有文献35，endostatin 还可以通过抑制内膜生成而延缓动脉粥样硬化的发展。型胶原、纤溶酶原、纤连蛋白(fribronectin)和催乳素(prolactin)这些前体大(隐蔽片段 crypticfragment)本身并

29、不是生成抑制剂，但通过多种蛋白水解酶的作用都可以出有抑制生成活性的片段。这说明肿瘤生成的调节是多水平的，这些丰富的前体蛋白以储备的形式抑制片段，维持的静止状态，抑制肿瘤生长。血小板因子-4 (PF-4）血小板因子-4 是血小板时a颗粒的肽类物质量为 7.8kDa。PF-4 通过阻断与 bFGF 受体结合，抑制内皮细胞自发游走和调节 bFGF 的促有丝活性，同时也阻断了 VEGF 与细胞活性36。表面硫酸肝素反应，抑制了 VEGF 促有丝血小板反应蛋白(Thrombospondin fragment, TSP)36罗丹丹学士文献综述血小板反应蛋白是一种糖蛋白，由内皮细胞、上皮细胞、成细胞、平滑肌

30、细胞、单核细胞和巨噬细胞所，可调控内皮细胞粘附、迁移和蛋白溶解活性。它是一种强生成抑制剂，野生型P53 就是上调 TSP 而抑制生成，P53 突变后其作用消失。TSP 能增强脂多糖和bFGF 刺激在炎症状态下的生成，可能是由于TSP-1下调了 VEGF 的表达21。其他因子白介素-12 (IL-12）除能调节免疫细胞活性，抗肿瘤和诱导 IFN生成外，新研究发现它能间接抑制生成，且毒性远比 IL-2 小。实验证明 IL-12 是通过诱导 IFN-g产生 IP-10 抑制生成，如果用抗IFN-g抗体可以消除 IL-12 抑制生成的作用37。干扰素-g (IFN-g）是量为 50kDa 的糖蛋白，对

31、许多正常和恶性转化细胞都有极强的抑制作用。IFN-g通过降低 aFGF 与内皮细胞表面受体的结合而抑制aFGF 所诱导的内皮细胞增殖作用38。IFN-a和 IFN-b通过下调节 bFGF和基质金属蛋白酶-9 (matrix mloproteinase-9，MMP-9）的表达来生成39、40。抑制生成因子的表达是肿瘤细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、周细胞、成细胞和免疫细胞间复杂的相互作用所产生的结果。几种细胞因子如 IL-1b、IL-6、PDGF-BB、TGF-b、IGF 和 HGF 在体内37罗丹丹学士文献综述都是生成的刺激因子，但在体外却未表现出此方面的作用，推测体内外的差别可能是由于体内存在着

32、例如 VEGF 等生成因子能够起到协同诱导的作用41、42。体内的一些其他因素例如氧气、葡萄糖、酸、PH 及乳酸水平均可以通过调节肿瘤生成因子的来生成43、44。间接地影响肿瘤的蛋白水解酶系统除去上述的各种因子外，蛋白水解酶系统在生成中也发挥着极其重要的作用。基质金属蛋白酶 (MMP)及其抑制剂 TIMP,纤溶酶原激活剂(plasminogen activitor, PA）及其抑制剂 PAI 是其中的代表。基质金属蛋白酶 (matrix mloproteinase , MMP)是一组锌离子依赖性的蛋白水解酶，目前发现的 MMPs 有 14 种（MMP1-14）。MMP 根据底物的不同可以分为

33、3 种亚型：间质胶原酶、明胶酶和基质溶解素，其中明胶酶能分解基底膜型胶原，与肿瘤进展和转移密切相关。各种 MMPs 的作用底物有一定的特异性，理论上如果激活全部的 MMPs，则可以降解各类胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等几乎全部的基底膜骨架成分。MMPs 参与生成时细胞外基质的降解过程，为细胞的移出开辟道路。MMP 可以被其天然的抑制剂 TIMP 所抑制，二者以 1：1 形成非共价结构，使 MMP 活性丧失。MMP/TIMP 的比率与肿瘤的侵袭和转移能力呈正相关，组织中二者比38罗丹丹学士文献综述率一旦失调就会发生病变。IL-1、佛波酯和 TNF-a可以与 MMP 起动子区的 AP1

34、元件结合从而诱导 MMP 的表达，而 TIMP的转录可以被微生成抑制剂转化生长因子 TGF-b下调。PA 最初是在血液循环系统中被发现，它可分为尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator, uPA）和组织纤溶酶原激活剂 (tissue plasminogen activator, tPA），它们属于丝氨酸蛋白酶，可使纤溶酶原转变为纤溶酶，从而水解蛋白原、纤粘连蛋白等，在血液凝固和组织重建过程中起者重要的作用，其中 uPA 与肿瘤的生长和转移关系较大。在肿瘤组织中，bFGF 可使内皮细胞的 uPA 表达升高，尤其是在内皮细胞迁移并形成管状结构的前沿处，u

35、PA 的含量最高。PAI 可以非共价地结合 PA 从而特异性抑制其活性。PAI 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，将 PAI转染肿瘤细胞后，发现它可以明显抑制肿瘤细胞的转移能力45。癌与肿瘤生成越来越多的证据表明，与获得生长能力一样，肿瘤细胞获得生成表型也是由于癌被连续激活和抑癌失活的结果。许多癌和抑癌还着具有调节生成作用的多种因子的产生。在进展早期观察到的生成峰值与许多癌被激活的时间相吻合。肿瘤细胞中某些癌的异常表达为内皮细胞启39罗丹丹学士文献综述动生成程序提供了信号，即增加生成刺激因子、限制抑制因子产生及促进细胞外基质降解。这些刺激源通过内皮细胞的相关46。受体触发信号传导过程，使内皮细胞产生应答

36、，形成新生p53 是参与调控细胞周期及细胞凋亡的一种重要白，野生型抑癌p53 可以通过下调内源性 VEGF 的 mRNA 及提高血小板生成47、48。p53反应蛋白-1 的表达间接地抑制肿瘤在肿瘤细胞中有很高的突变率，突变使肿瘤组织耐受低氧并开启生成。Ras 是一种鸟苷三磷酸结合蛋白，在内皮细胞活化中表现出重要的作用。H-ras 激活，促进内皮细胞非定向移动。进一步研究表明，ras 不仅激发细胞迁移信号，而且对迁移性表型的持续存在都是必须的。Ras 能使培养的内皮细胞“永生”。Ras、fos 前癌、v-src 均可诱导 VEGF 的表达。Ras 和 Src 还可以诱导金属蛋白酶和潜在的蛋49。

37、白酶激活剂的免疫系统与肿瘤生成免疫系统对生成的调节起着重要的作用。一方面，白细胞可以引起内皮细胞的增殖，白细胞所表达的一些细胞因子也可以诱导生成；另一方面，生成对免疫细胞及正常免疫反应的发展都有着重要的影响。肿瘤的生成增加了白细胞可粘附的内皮细胞总面积，如果肿瘤组织没有一个能调节白细胞和内皮细胞相互作40罗丹丹学士文献综述用的机制，则肿瘤细胞将会受到免疫细胞的。许多研究都报导了肿瘤中白细胞和内皮细胞相互作用降低的现象50、51，其可能是内皮粘附表达的减少。有研究报导肿瘤组织中参与白细胞反应的内皮粘附如细胞间粘附(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）

38、、ICAM-2、CD-34 的下调节，及肿瘤组织对 TNF-a和 IFN-g介导表达的细胞粘附E-selectin 和细胞粘附 -1 (vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)有阻断效应52。这些结果都证实了肿瘤生成所诱导的内皮细胞无细胞免疫反应性53，粘附的下调节可能是由生成的信号所引起，这也导致了白细胞作用的下调节。有人设想抑制肿瘤生成可以对抗肿瘤逃避免疫监测52。此想法也产生了一个新的治疗，即通过调节肿瘤组织的内皮粘附的表达来介导炎性细胞的浸润以达到治疗的目的。手术对肿瘤生成的影响临床和实验证据提示愈合伤口是转移灶的免疫学易发部位，手术和伤口的愈合

39、通过促进生成而参与肿瘤的复发。VEGF 是伤口愈合的必须因子，但也促进微转移灶的生长。或腹腔镜术后，内毒素可扩散至腹腔和全身循环，由此直接增加巨噬细胞的 VEGF 生成，手术创伤也增加了白细胞的数量和活力，这些都有助于肿瘤的生41罗丹丹学士文献综述长和转移54。肿瘤通过一些内源性生成抑制因子，如TSP-1、angiostatin、endostatin 等，直接或间接地调节转移灶的生长。肿瘤转移灶由于抗生成因子的抑制且缺乏血供，其凋亡和增殖取得了平衡，保持“休眠”状态。手术切除肿瘤后，去除了抑制因子，导致了原先休眠的微转移灶生长。临床实验证明肿瘤产生的 angiostatin、endostati

40、n 在其切除后 5 天内从血循环中消失21。促生成因子如 VEGF 在血循环中的半衰期只有 3 分钟左右，而抑制因子如 endostatin 的半衰期则长达 2.5 天。因此，诱导因子只能立即作用于周围的微环境，而抑制因子则具有系统全身作用，这也是为什么肿瘤具有抑制其转移灶生长的一个解释5。故手术及以后的伤口愈合改变了生成促进和抑制因子的动力学平衡，提供了微转移灶生长的环境。这使得抗肿瘤生成在围手术期应用显得尤为重要。随着人们对调控肿瘤微生成的机制及其肿瘤侵袭和转移关系的深入了解，必将对设计和寻找有效的抗癌起到巨大的推动作用，为攻克提供新的思路和措施。三.抗生成治疗的研究进展1935 年，He

41、rtrg 在观察胎盘组织新生形成的过程时首次提出了“生成(angiogenesis）”的概念。，Folkman 首次提42罗丹丹学士文献综述出“肿瘤的生长和转移依赖于生成”的观点，并假设通过抑制血管生成可以抑制肿瘤的生长，当时这一提法被认为是不切实际的理论。随着 Folkman 及其同事 20 多年的努力，人们对这一领域的认识已有了长足的提高，这一假设也得到了极好的验证，当年的批评者如今有不少已成为 Folkman 在这一研究领域的竞争对手。抗生成治疗 (anti-angiogenesis therapy）是将生成的各个阶段作为治疗的靶来限制和预防肿瘤的生成，其最终目的是维持肿瘤处于相当小的细

42、胞簇，使其转移潜能低下，易受细胞免疫的和化疗及放疗的破坏。近期提出的“休眠”理论是与生成密切相关的，所谓的休眠是指肿瘤出现后，转移灶可在几到几年内保持无症状而不被发现，实质上肿瘤并未休眠，其所以不增加体积是由于肿瘤细胞的增殖被同等速度的细胞凋亡所平衡。生成抑制因子转移灶的生长是通过增加肿瘤细胞的凋亡而实现的。Folkman 采用阻断生成的方法，即阻断癌细胞的营养来源来抑制其增殖，最终能导致肿瘤的消退，这就是肿瘤休眠疗法 (tumordormancy therapy)的理论依据。肿瘤生成抑制剂 (tumor angiogenesis inhibitor, TAI)是一类能破坏或抑制生成，有效地肿

43、瘤生长和转移的。TAI与传统相比具有疗效高、副作用小和不易产生耐药性等优点。目43罗丹丹学士文献综述根据其作用机理可分为以下类3、16、58、60：前 TAI 类1直接抑制内皮细胞此类可以直接抑制激活的内皮细胞的增殖和/或促进其凋亡，如 TNP-470、thalidomide、squalamine、combretastatinA-4Prodrug和 endostatin。2抑制肿瘤生成的信号传导拮抗生成刺激因子与细胞表面受体的结合抗 VEGF 和FGF 的单克隆抗体可以直接抑制 VEGF 的作用，目前以此种抗体运载毒素肿瘤细胞已用于治疗肿瘤。抑制肿瘤细胞内酪氨酸激酶的活性由于 VEGF 受体和

44、 bFGF 受体均为酪氨酸激酶受体，其胞内酪氨酸激酶通过磷酸化作用而起到信号传导的作用。目前发现的化合物 PD166866 和 PD173074，选择性地抑制了 FGF 和 VEGF 受体酪氨酸激酶的活性。粘附拮抗剂LM109 为含有 RGD 序列的整和素avb3 的单抗，诱导增殖的内皮细胞凋亡，凋亡指数提高 6 倍，对已生成的无效。SC-68448 为模仿 RGD 的化合物，特异性识别avb3，抑制生成。整和素抗体Vitaxin 和整和素小阻断剂EMD121974 也是通过抑制44罗丹丹学士文献综述整和素的生物学活性而发挥效应。钙离子拮抗剂羧基氨咪唑通过阻断配体激活的钙离子内流以及第二信使花

45、生四烯酸和肌酸多聚磷酸酯的稀释，抑制信号传导通路。在体内抑制 bFGF 激活的内皮细胞增殖和毛细的形成，减少细胞外基质蛋白的粘附和游走，内皮细胞的侵入。3阻断生成刺激因子的及此类可以选择性地抑制一种或几种促生成因子的作用。如 VEGF 抑制剂 SU5416、PTK787、ZK22584 可以阻断 VEGF受体；SU6668 则可以阻断 VEGF、bFGF、PDGF 受体；PPS 可以阻断 bFGF 受体；IFN-a可以抑制 bFGF 和 VEGF 的。4抑制胞外蛋白降解酶的活性此类是天然或的MMPs 抑制剂，通过和多种MMPs结合并抑制其活性，防止细胞外基质的降解和基底膜的破坏，限制肿瘤生成。

46、目前研究较多的此类包括有 TIMPs、marimastat、AG3340、COL-3、Neovastat、BB-94 和 BMS-275291。5其他泰素(taxol）白细胞介素-12 不仅对内皮细胞有作用，而且对肿瘤细胞、其他细胞都有作用，属于非特异性生成抑制剂。45罗丹丹学士文献综述抗生成治疗的临床应用前景：1. 预防微小肿瘤和微小转前期过度到期，还可以使大的实体瘤退缩55。2. 与移瘤从传统的治疗联用，对放疗和化疗起到增效的作用。由于肿瘤病理性的高渗透性和肿瘤缺乏淋巴回流，肿瘤的生长伴随着间质增高，导致肿瘤的受压及中心区域的坏死。抗生成治疗通过降低间质而增加了进入肿瘤组织的化疗，且使肿瘤

47、细胞处于休眠状态，对放疗更为敏感56。3. 各种生成抑制剂的使用。肿瘤生成是有很大冗余度的多途径调节过程，一个生成刺激因子可以和许多配体结合而产生作用。一种配体的特异性抗生成治疗可能在开始阶段有效，但在后期此种治疗可能会造成由另一种配体所驱动的肿瘤生成57。4.生成抑制剂还可以作为化学预防性应用。这不同于经典的化学预防概念，因为它不能防止正常细胞转化成癌细胞。然而，生成抑制剂可用于防止有家族史或复发的高危人群出现临床体征和威胁生命的癌灶58。目前临床评价抗生成疗效的已有了很大的发展。可采用超声彩色多普勒技术检测肿瘤的血流情况，或采用正电子发射断层成像技术(PET)检查肿瘤的代谢情况。临已开始用

48、肿瘤密度或微计数肿瘤的侵袭度、对化疗的敏感度及预后。另外还可以通过检测血和尿液中的 bFGF 和 VEGF 来评价疗效59。46罗丹丹学士文献综述随着越来越多的抗肿瘤生成进入临床实验，一些与之相关的新问题也越来越引起人们的重视57。1. 如何为一个具体的选择一种适当的抗生成治疗的方案。2. 如何适时地终止抗血管生成治疗。3. 如何在肿瘤生长速率改变或的生存情况变得明显好转之前选用一种能够迅速准确地反映抗生成疗效的指标。4. 对于多发的、于不同微环境的肿瘤是否会对同一种抗生成产生类似的反应。随着生成抑制剂研究的不断深入，陆续有新的抑制剂被发现。人们正在深入研究肿瘤生成机制，寻找特异的生成标志作为

49、靶点，开发广谱、高效、低毒和特异性高的内源性生成抑制剂。总的看来肿瘤生成抑制剂，必将由自然生成转向人工，由动物实验向临床应用过渡，具有广阔的研究和应用前景。47罗丹丹学士文献综述第二部分鸡胚绒毛生成评价系统的形成包括两种不同的方式：建成（vasculogenesis）和生成（angiogenesis）。前者是指在胚胎发生期，由中胚层的成血管细胞发育成初级的。后者是指已有通过出芽或的方式形成新的网1。成年后的新形成的主要途径是生成，即已有的分化了的内皮增殖、迁移形成新的。生理状态下的血管生成发生于女性周期（、胚胎植入、妊娠）、胚胎发育、形成、毛发生长、伤口愈合、炎症反应、组织再生和重建，这些都是

50、局限于一定程度、区间和期间而且受到严格的非病理过程。许多疾病如视网膜病变、关节炎、银屑病、瘤、肿瘤都伴随着异常的生成。在这些病理状态下，生成是失控的，持续时间长，而且一般自动回到静止状态。一般而言，正常成年人的内皮细胞几乎处于不的静止状内皮细胞中只有一个处于细胞周期2，但在态，约 10000 个48罗丹丹学士文献综述上述病理或生理情况下，内皮细胞的更新周期由数百天缩短至五天，与骨髓细胞水平相当3。调节生成在临床和基础研究中有许多意义深远的应用。例如生成的下调节将有 利于肿 瘤(Billington,1991;Folkman,1990;Liotta,1991;PaweletzandKnierim

51、,1989)、瘤、慢性炎症(Schweigerer and Fotsis,1992)和银屑病(Eric Dupont.,1998)的治疗。生成的上调节将有利于移植物的存活和伤口的愈合(Arnold and West,1991)。上调或下调作用还可以调节不周期、受孕、辅助发育不良的胎盘完全发育(Findlay,1986;Reynolds.,1992)。Richard K 曾指管生成无论上调节或下调节是 20 到 40 种疾病发病、及复发的中心环节。因此生成因子（刺激或抑制因子）的发现将很有可能成为治疗由病理性生成所引起或与之有关的一系列疾病的新，并为这些疾病的医疗理论、治疗开创一个全新的前景。随着生成因子研究的不断深入，同时还发展出许多评价这些因子作用的动物模型和实验方法。体内外实验技术的成熟使研究生成中的每一步都成为可能，特别是内皮细胞的转移、增殖、分化和4。体外实验包括用细胞计数方法分析内皮细胞的增殖率、活动性以及跨膜趋化性，在胶原和人工三底膜（Matrigel）上接种内皮细胞以观察微的49罗丹丹学士文献综述形成（Jain.,1997）。体内实验方法一般是利用微丰富的组织为实验材料