第五章动物细胞融合与单克隆抗体技术

1、第五章动物细胞融合与单克隆抗体技术5.1 细胞融合与杂交一、概念一、概念v细胞融合：两个或两个以上相同的细胞细胞融合：两个或两个以上相同的细胞合并形成一个细胞的过程。合并形成一个细胞的过程。v细胞杂交：两个或两个以上不同的细胞细胞杂交：两个或两个以上不同的细胞合并形成一个细胞的过程，包括种内杂合并形成一个细胞的过程，包括种内杂交和种间杂交。交和种间杂交。二、原理二、原理 异核体阶段杂种细胞形成同核体异核体合核体关键是膜的融合：v两个亲本细胞并列，细胞膜接触v膜组织局部破坏v形成包围融合细胞的连续胞膜细胞融合过程可分为：细胞融合过程可分为：凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关凝集：细胞凝集与细胞膜

2、的糖蛋白有关蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提脂质分子重排：是实现细胞融合的关键脂质分子重排：是实现细胞融合的关键胞质合并：后续的稳定步骤。胞质合并：后续的稳定步骤。1.病毒介导融合：（1）诱导原理三、细胞融合方法（2）操作步骤(3) 病毒诱导融合的特点2.2.化学融合剂诱导融合（化学融合剂诱导融合（P107P107）（1）化学融合剂的种类三、细胞融合方法（2）PEG诱导的原理 （3）PEG诱导的特点sp3杂化，有孤对电子，可与H2O形成H键而具有强烈的吸水性。3.电融合技术电融合技术三、细胞融合方法v电融合的特点电融合的特点 融合频率高，对细胞伤

3、害小融合频率高，对细胞伤害小正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞非特异性融合非特异性融合三、细胞融合方法磁-电融合声-电融合电-机械融合细胞化学聚集融合生物素-抗生物素-抗原-抗体桥联4. 激光诱导细胞融合激光诱导细胞融合（1）原理：）原理： 光镊所形成的光学势阱会把细胞拉向光束中心，光镊所形成的光学势阱会把细胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远距离、非接钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远距离、非接触式捕获。触式捕获。（2）特点：）特点： 可对单个核细胞进行操作，但设备昂贵，操作技术要可对单个核细胞进行操作，但设备昂贵，操作技术要求高。

4、求高。三、细胞融合方法三、细胞融合方法5. 微流控芯片的细胞融合技术微流控芯片的细胞融合技术（1 1）原理：）原理： 将微通道网络整合到生物芯片上，使得微流控将微通道网络整合到生物芯片上，使得微流控系统成为细胞融合的理想平台系统成为细胞融合的理想平台（2 2）特点：）特点： 实现大量单个成对细胞的融合实现大量单个成对细胞的融合（二）细胞融合的方法（二）细胞融合的方法6.6.细胞融合的影响因素细胞融合的影响因素v细胞的种类和性质细胞的种类和性质 细胞表面性质细胞表面性质 细胞种类细胞种类 亲本细胞的亲缘关系亲本细胞的亲缘关系v融合温度及融合温度及PH等环境条件等环境条件v离子强度及离子种类离子强

5、度及离子种类三、细胞融合方法四、四、 融合子检出的选择系统融合子检出的选择系统v遗传互补选择遗传互补选择v营养缺陷型互补选择营养缺陷型互补选择v抗性互补选择抗性互补选择v形态特征互补选择形态特征互补选择v生长特性选择生长特性选择H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶五、融合子的鉴定方法五、融合子的鉴定方法v细胞学鉴定：染色体数目，形态结构细胞学鉴定：染色体数目，形态结构v生化分析：同工酶谱为双亲的总和生化分析：同工酶谱为双亲的总和v分子生物学鉴定：分子生物学鉴定：DNA探针探针六、细胞融合技术的应用六、细胞融合技术的应用v基因定位和人类基因图谱绘制基因定位和人类基因图谱绘制v肿瘤免

6、疫的研究：肿瘤树突状细胞疫苗肿瘤免疫的研究：肿瘤树突状细胞疫苗v单克隆抗体的生产单克隆抗体的生产v动物新品种的培育动物新品种的培育5.2 杂交瘤技术杂交瘤技术一、一、B淋巴细胞杂交瘤技术淋巴细胞杂交瘤技术原理：细胞融合原理：细胞融合+克隆选择理论克隆选择理论 Emil von Behring, 1901, antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987, structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter,

7、 1972, structure of antibodyPaul Ehrlich , 1908, production of antibodyNobel Prize winners免疫球蛋白的免疫球蛋白的单体分子结构单体分子结构 饲养细胞的作用：饲养细胞的作用：v提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。繁殖。v腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。单个细胞克隆的生长。v饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。细

8、胞分裂、增殖的作用。饲养细胞的制备：腹腔巨噬细胞7. 7. 杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏v目的：目的：保种保种v方法：方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10DMSO和和10FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。v复苏：复苏：如果冻存的细胞是来自如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也孔板的一孔，复苏后也应接种到应接种到96孔板的一个孔中孔板的一个孔中8.8.单克隆抗体的规模化生产单克隆抗体的规模化生产 主要有两种方

9、法主要有两种方法（1 1）体外法：用人工反应器大量培养杂交瘤细胞）体外法：用人工反应器大量培养杂交瘤细胞（2 2）体内法：用生物体作为细胞反应器大规模培养杂）体内法：用生物体作为细胞反应器大规模培养杂交瘤细胞交瘤细胞转瓶培养微载体培养9.9.融合后杂交瘤不生长的原因分析：融合后杂交瘤不生长的原因分析：v聚乙二醇有毒聚乙二醇有毒v小牛血清的质量有问题；小牛血清的质量有问题；v支原体污染支原体污染vHATHAT有问题有问题10.10.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体原因分析杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体原因分析 融合后经融合后经HATHAT选择有细胞克隆出现，但不能选择有细胞克隆出现，但不能

10、筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因是：筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因是：v抗体检测法不够敏感抗体检测法不够敏感vHATHAT选择失败选择失败v动物免疫不成功动物免疫不成功v染色体丢失和克隆竞争染色体丢失和克隆竞争三、三、T淋巴细胞杂交瘤淋巴细胞杂交瘤v概念：概念：T淋巴细胞亚群经有丝分裂原刺激后能淋巴细胞亚群经有丝分裂原刺激后能分泌多种淋巴因子。将之与胸腺瘤或淋巴瘤分泌多种淋巴因子。将之与胸腺瘤或淋巴瘤BW5147株融合而建立的株融合而建立的T淋巴细胞杂交瘤株。淋巴细胞杂交瘤株。v淋巴因子：干扰素、白细胞介素淋巴因子：干扰素、白细胞介素2、巨噬细胞激、巨噬细胞激活因子等活因子等四、抗体

11、的发展现状四、抗体的发展现状v人鼠型杂交瘤：人淋巴细胞人鼠型杂交瘤：人淋巴细胞+鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞 问题：易丢失人染色体问题：易丢失人染色体v人型杂交瘤：人淋巴细胞人型杂交瘤：人淋巴细胞+人骨髓瘤细胞人骨髓瘤细胞 问题：尚未获得理想的瘤系，问题：尚未获得理想的瘤系， 建株困难，抗体产量太低等建株困难，抗体产量太低等1.人源单克隆抗体2.鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体v鼠衍生杂交瘤：鼠衍生杂交瘤： 问题：出现人抗鼠抗体反应问题：出现人抗鼠抗体反应 鼠抗体不能有效激活人免疫系统鼠抗体不能有效激活人免疫系统(1)(1)抗体抗体DNADNA重组重组 通过基因工程技术用人蛋白取代鼠抗体的恒定区，通过

12、基因工程技术用人蛋白取代鼠抗体的恒定区，仍保留鼠蛋白在抗体中的可变区，形成约含有仍保留鼠蛋白在抗体中的可变区，形成约含有65%65%人人蛋白的嵌合抗体。蛋白的嵌合抗体。 问题：含有一定量的鼠蛋白，亲和力差，产量低，问题：含有一定量的鼠蛋白，亲和力差，产量低，纯化费用高，临床效果差纯化费用高，临床效果差3.基因工程抗体人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体(2)(2)噬菌体表达技术噬菌体表达技术 用体外基因克隆技术将用体外基因克隆技术将B B细胞全套可变区基因克隆出来，细胞全套可变区基因克隆出来，插入噬菌体表达载体，转化工程细菌进行表达。插入噬菌体表达载体，转化工程细菌进行表达。问题：问题：没有经过天然抗体成

13、熟，亲和力低没有经过天然抗体成熟，亲和力低需要相当复杂的抗体基因技术和多轮筛选才能获得。需要相当复杂的抗体基因技术和多轮筛选才能获得。3.基因工程抗体基因工程抗体(3)(3)外因鼠技术外因鼠技术 将小鼠体内产生抗体的基因灭活，然后将人的抗体基因转将小鼠体内产生抗体的基因灭活，然后将人的抗体基因转入小鼠早期胚胎，获得含有人抗体的小鼠入小鼠早期胚胎，获得含有人抗体的小鼠外因鼠。外因鼠。 前景：前景：100%100%全人源化单克隆抗体全人源化单克隆抗体 20112011年全球有年全球有7 7种治疗性全人单克隆抗体获得美种治疗性全人单克隆抗体获得美国国FDAFDA和欧盟的批准，这些全人抗体几乎完全由转基因小鼠和欧盟的批准，这些全人抗体几乎完全由转基因小鼠产生。产生。3.基因工程抗体基因工程抗体五、单克隆抗体的应用五、单克隆抗体的应用v疾病的诊断或特异性抗原（蛋白）的检测疾病的诊断或特异性抗原（蛋白）的检测免疫胶体金快速检测试纸v疾病的诊断或特异性抗原（蛋白）的检测疾病的诊断或特异性抗原（蛋白）的检测v被动免疫治疗被动免疫治疗v大分子蛋白的提纯大分子蛋白的提纯v生物导向药物生物导向药物五、单克隆抗体的应用五、单克隆抗体的应用生物导向药物生物导向药物H