第五章植物细胞培养及原生质体培养

1、第五章植物细胞培养及原生质体培养 园艺植物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工园艺植物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法和技术，在细胞水平上研究改造园艺植物遗传特性和程学的试验方法和技术，在细胞水平上研究改造园艺植物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或园艺植物新品种的技术。生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或园艺植物新品种的技术。分为广义上的细胞工程和狭义上的细胞工程。分为广义上的细胞工程和狭义上的细胞工程。 广义上的细胞工程包括：植物组织和器官培养、细胞培养、广义上的细胞工程包括：植物组织和器官培养、细胞培养、原生质体培养和融合、亚细

2、胞水平的操作等。狭义上的细胞工原生质体培养和融合、亚细胞水平的操作等。狭义上的细胞工程是指细胞培养、原生质体培养及融合（体细胞杂交）、染色程是指细胞培养、原生质体培养及融合（体细胞杂交）、染色体操作及制作遗传转化受体等内容。体操作及制作遗传转化受体等内容。 第一节第一节 园艺植物细胞培养园艺植物细胞培养 在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体植物细在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体植物细胞生长繁殖的方法。胞生长繁殖的方法。 细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育与分化等理论以及细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育与分化等理论以及用于植物次生代谢物质生产。用于植

3、物次生代谢物质生产。一、植物细胞培养一、植物细胞培养(cell culture)的特性：的特性： 1. 植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差；植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差； 2. 细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素；细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素； 3. 细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达350 um一一400 um 的的团块，悬浮培养较困难；团块，悬浮培养较困难； 4. 培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群

4、体效应群体效应 5. 培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。全能性。1 1 二、植物细胞培养的营养需求及培养基二、植物细胞培养的营养需求及培养基. 营养需求：营养需求： 植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂，除水分外，植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂，除水分外，其它营养成分可分为如下几类其它营养成分可分为如下几类： (1) 无机营养无机营养: 如如N、 P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；等； (2) 维生素：如维生素维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸

5、等；、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等； (3) 碳源碳源: 如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等； (4) 天然物天然物: 如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等；汁、生梨汁及苹果汁等； (5) 植物激素植物激素: 如生长素如生长素 、赤霉素、细胞分裂素、赤霉素、细胞分裂素 、脱落酸；其它有油菜素内酯、脱落酸；其它有油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸类氨基酸类

6、: 如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7) 核酸及其水解物核酸及其水解物: 如如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等；、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等；(8) 其它成分其它成分: 如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等. 2. 培养基：

7、培养基： (1)固体培养基：添加琼脂等固体培养基：添加琼脂等 (2) 液体培养基：不加琼脂等液体培养基：不加琼脂等三、三、 植物细胞培养技术植物细胞培养技术 细胞培养技术主要包括单细胞培养（微室培养、平板培养、细胞培养技术主要包括单细胞培养（微室培养、平板培养、看护培养、悬滴培养、微滴培养）、悬浮培养、固相化培养等看护培养、悬滴培养、微滴培养）、悬浮培养、固相化培养等多种培养方式。多种培养方式。单细胞培养：单细胞培养：对分离的单细胞进行培养的方法。对分离的单细胞进行培养的方法。（1）单细胞的分离：）单细胞的分离：从叶片直接分离：从叶片直接分离： 采用机械法（将叶片轻轻研碎、然后过滤和离心纯化）

8、或酶解法（采采用机械法（将叶片轻轻研碎、然后过滤和离心纯化）或酶解法（采用果胶酶处理叶片）由叶肉细胞分离。用果胶酶处理叶片）由叶肉细胞分离。B. 从愈伤组织分离：从愈伤组织分离： 由离体组织获得愈伤组织，再由愈伤组织分离单细胞通过愈伤组织由离体组织获得愈伤组织，再由愈伤组织分离单细胞通过愈伤组织振荡培养、过滤和离心等步骤分离单细胞。振荡培养、过滤和离心等步骤分离单细胞。单细胞培养方法：单细胞培养方法：（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。的培养皿内的培养过程称为平板培养法。 方法是将经机械破碎

9、过筛或酶方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等纤维素酶及果胶酶等)消化分散的消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经计数及稀释，接种到加热熔化细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至而刚冷却至35左有的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石左有的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于蜡密封，于25含含5CO2空气的培养箱中培养，细胞即可生长空气的培养箱中培养，细胞即可生长成团。成团。（2）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而毛

10、细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。（3）微室培养法：悬浮）微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养内的固体培养基中的培养方法。方法。（4）条件培养：）条件培养： 是指采用条件培养基进行培养单细胞的方法，条件培养基是指采用条件培养基进行培养单细胞的方法，条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细是在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使

11、培养基条件化，简单的方胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化，简单的方法是采用液体培养基培养法是采用液体培养基培养4-6周高密度细胞过滤掉，制成液体或周高密度细胞过滤掉，制成液体或固体培养基接种单细胞。固体培养基接种单细胞。（5）纸桥培养：）纸桥培养： 是用于植物茎尖分生组织细胞培养的方法，也可用于单细胞。是用于植物茎尖分生组织细胞培养的方法，也可用于单细胞。是使滤纸的两端进入培养基，中央部分露出培养基表面，将所是使滤纸的两端进入培养基，中央部分露出培养基表面，将所要培养的细胞置于滤纸上培养。（要培养的细胞置于滤纸上培养。（P80，图，图5-4）2. 悬浮培养法：悬浮培养法： 植物细胞悬

12、浮培养植物细胞悬浮培养(cell suspension culture) 即植物细胞或即植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床 上进行悬浮培养，使之上进行悬浮培养，使之在体外生长和发育，并保持良好的分散性。在体外生长和发育，并保持良好的分散性。 特点：可以工厂化生产，提供大量一致的细胞特点：可以工厂化生产，提供大量一致的细胞 悬浮细胞的来源：愈伤组织，某个器官或组织，甚至幼嫩的植悬浮细胞的来源：愈伤组织，某个器官或组织，甚至幼嫩的植株，通过物理或化学的方法进行分离而获得。株，通过物理或化学的方法进行分离而获得。 (1) 优良的悬浮细胞培养体系必需满足：优

13、良的悬浮细胞培养体系必需满足： A. 悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。下的细胞组成。 B. 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。 C. 生长迅速，悬浮细胞的量一般生长迅速，悬浮细胞的量一般23天甚至更短时间便可增天甚至更短时间便可增加一加一。(2) 培养过程：培养过程：将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根尖及叶肉组织，将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根尖及叶肉组织，经匀浆器破碎、不锈钢网过滤，单细胞滤液作为按种材料，接种于液经匀浆器破碎、不锈钢网过滤，单细胞滤

14、液作为按种材料，接种于液体培养基中振荡培养。体培养基中振荡培养。(3) 悬浮培养特点：悬浮培养特点：培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达最高点，培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过程表现出严格生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生物相同，有延滞期、可重复周期性变化，细胞增长规律与微生物相同，有延滞期、对数生长期、直线生长期、减慢期及静止期等阶段。植物细对数生长期、直线生长期、减慢期及静止期等阶段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25

15、x l0细胞细胞ml 一一0. 5 x 10细胞细胞m1。细胞生长曲线细胞生长曲线 (4)悬浮培养类型：悬浮培养类型： A. 分批培养分批培养(Batch culture)： 分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养。细胞材料生长在分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养。细胞材料生长在已固定体积的培养基中。随着细胞数量的增加，培养基营养的消耗已固定体积的培养基中。随着细胞数量的增加，培养基营养的消耗及某些其他因子的积累会使细胞停止生长。及某些其他因子的积累会使细胞停止生长。 继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液中。生长过程继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液中。生长过程包括延迟期、指

16、数期、静止期等。包括延迟期、指数期、静止期等。 分缓慢转动培养（分缓慢转动培养（1-2rpm）、震荡培养（）、震荡培养（100rpm）、快速转动培养）、快速转动培养（80-120rpm）和搅拌培养。）和搅拌培养。B. 连续培养连续培养(Continuous culture): 是用一定容积的特定容器中进行是用一定容积的特定容器中进行 细胞培养的方法，在培养过细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。分为封闭式和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。分

17、为封闭式连续培养和开放式连续培养。连续培养和开放式连续培养。 最大特点是细胞生长速率标准一致，新形成的细胞补偿了被排出的细最大特点是细胞生长速率标准一致，新形成的细胞补偿了被排出的细胞，系统内细胞密度、生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。胞，系统内细胞密度、生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。 化学恒化法：通过营养液或某一成分的含量进行控制。化学恒化法：通过营养液或某一成分的含量进行控制。 浊度恒定法：比浊计或分光光度计测定浑浊度而进行流量控制。浊度恒定法：比浊计或分光光度计测定浑浊度而进行流量控制

18、。C.半连续培养：半连续培养： 利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式，当培养罐内细胞利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式，当培养罐内细胞数量增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐内，数量增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此反复进行再培养。再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此反复进行再培养。半连续培养能够获得大量均匀一致的培养细胞。半连续培养能够获得大量均匀一致的培养细胞。（5）悬浮培养细胞的同步化：）悬浮培养细胞的同步化：同步化培养室之培养基中的大部分细胞同步化培养室之培养基中的大部分细胞都能同时通过细胞周期（都能同时通过细胞周期（

19、G1、S、G2 和和M）的各个阶段。实现悬浮细胞同步）的各个阶段。实现悬浮细胞同步化的方法有：化的方法有： A 饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在使细胞停滞在G1或或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新加入该限制因子时，期，经过一段时间的饥饿后，当重新加入该限制因子时，静止细胞就会同时进行分裂。静止细胞就会同时进行分裂。 B 抑制法：使用抑制法：使用DNA合成抑制剂，如合成抑制剂，如5-氨基嘧啶等也可以使细胞同步化。氨基嘧啶等也可以使细胞同步化。由于核酸类似物的存在阻止了由于核酸类似物的存

20、在阻止了DNA的合成，细胞周期只能进行到的合成，细胞周期只能进行到G1期，细胞期，细胞都滞留在都滞留在G1或或S期的边界，当去除抑制剂后，细胞就进入同步分裂。期的边界，当去除抑制剂后，细胞就进入同步分裂。 C. 采用发酵器系统进行同步化：通过充入氮气的方法控制细胞分裂采用发酵器系统进行同步化：通过充入氮气的方法控制细胞分裂活力，然后恢复普通空气状态时再度分裂。活力，然后恢复普通空气状态时再度分裂。 （6）悬浮培养细胞的植株再生：）悬浮培养细胞的植株再生： 悬浮培养细胞形成体细胞胚或诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组悬浮培养细胞形成体细胞胚或诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织再生植株。织再生植株。

21、（7）影响悬浮培养的因素：）影响悬浮培养的因素：A 培养基：通常需要高硝态氮和銨态氮，以及含磷量高的培养基。培养基：通常需要高硝态氮和銨态氮，以及含磷量高的培养基。B. 细胞密度：最低密度为细胞密度：最低密度为0.5105 1.0105 。C. 植物激素和其他附加成分植物激素和其他附加成分: 添加适当浓度的激素和氨基酸。添加适当浓度的激素和氨基酸。D. 培养基培养基pH值：通过调节营养比例或加入化学成分稳定值：通过调节营养比例或加入化学成分稳定pH值。值。E . CO2浓度：低密度培养中，浓度：低密度培养中，CO2对于诱导细胞分裂有较大的影响，需控对于诱导细胞分裂有较大的影响，需控制适当浓度。

22、制适当浓度。3. 固相化培养技术：固相化培养技术： 细胞固定在一定的惰性基质中，如琼脂、海藻酸盐、聚丙细胞固定在一定的惰性基质中，如琼脂、海藻酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上，细胞不能运动，但营养液可以在基质中流烯酰氨纤维膜上，细胞不能运动，但营养液可以在基质中流动。动。（1）固相化培养的特点：）固相化培养的特点： A. 消除剪切力；消除剪切力； B. 细胞生长缓慢，促进次生代谢过程；细胞生长缓慢，促进次生代谢过程； C. 细胞之间紧密接触，形成梯度，利于产物积累；细胞之间紧密接触，形成梯度，利于产物积累； D. 便于操作，不易污染。便于操作，不易污染。 E. 便于产物收集。便于产物收集。 第二节第二

23、节 园艺植物原生质体培养园艺植物原生质体培养 通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体质体(Protoplast)。游离的原生质体在一定条件下培养可以重新形成细胞。游离的原生质体在一定条件下培养可以重新形成细胞壁，并像正常的植物细胞那样具有全能性，经过适当的培养可以再生出壁，并像正常的植物细胞那样具有全能性，经过适当的培养可以再生出完整植株。完整植株。蝴蝶兰原生质体培养和植株再生蝴蝶兰原生质体培养和植株再生 （图片引自（图片引自Plant Cell Reports，2007，26：719-725）非洲百合原生质体培

24、养和植株再生非洲百合原生质体培养和植株再生（Agapanthus praecox）（图片引自）（图片引自Plant Cell, Tissue and Organ Culture ，2003，72（1）：）：63-69）球根鸢尾原生质体培养和植株再生（图片引自球根鸢尾原生质体培养和植株再生（图片引自Euphytica，1999，105: 99102）针叶石竹叶片原生质体培养及植株针叶石竹叶片原生质体培养及植株再生（图片引自再生（图片引自In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant 2005, 41:794800）仙客来原生质体培养及体胚途径再生仙客来原生质体培养及体胚途径再生（图

25、标引自（图标引自Plant Cell Tiss Organ Cult, 2010, 101:171182） 一、原生质体培养的意义一、原生质体培养的意义 （1）原生质体可以作为体细胞无性系变异和突变体筛选的材）原生质体可以作为体细胞无性系变异和突变体筛选的材料；料； （2）利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外）利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取源物的摄取(病毒、微生物、外源遗传物质病毒、微生物、外源遗传物质)；（3）原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞）原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。即体细胞杂交）。（4）是植物基因工程的理想受

26、体，用外源遗传物质对植物原生质）是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。程植株。（5）也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病）也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。理学研究的有用工具。 自自1970年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有体获得再生植株的植物约有280余种，其中有余种，其中有20种为我国首先报种为我国首先报道。道。

27、 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。(一一) 原生质体的制备：原生质体的制备：1、材料来源与预处理：、材料来源与预处理：（1）材料来源：）材料来源： 可以采用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培可以采用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。 （2）预处理：预处理： A.预质壁分离预质壁分离：17-20 酶液中静置半小时，再于酶液中静置半小时，再于2834保温，或将材保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养料置于与酶

28、液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；壁分离目的； B. 预培养预培养: 将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高；酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高； C. 暗处理暗处理: 将室温下生长将室温下生长57个星期的植物材料在黑暗中放置个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片以上，取其叶片制备的原生质体有活力；制备的原生质体有活力； D.D.光处理光处理: 将叶片于日光或灯光下照射将叶片于日光或灯光下照射26h令其萎蔫

29、，利于撕除下表皮及原令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离；生质体分离； E.E.低温处理低温处理: 夏季应用的实验材料其萌动种子应于夏季应用的实验材料其萌动种子应于4过夜后再播种，从其过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。2. 制备原生质体的酶类：制备原生质体的酶类： 高等植物细胞壁主要成分为高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、果纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择与结构

30、不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。（引自（引自K.-H. Neumann et al., Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2009）常用的酶类有：常用的酶类有：A. 纤维素酶（纤维素酶（Cellulase ），如），如Onozuka R10及及RS，国内常用的为，国内常用的为EA3867，其中含少量果胶酶；，其中

31、含少量果胶酶；B. 果胶酶（果胶酶（Pectinase ），如），如Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2，作用时间长有毒害，作用时间长有毒害作用；此外亦用作用；此外亦用Pectalyase Y23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为用量一般为01，悬浮细胞为，悬浮细胞为005；C. 崩溃酶（崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性；，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性；D. 半纤维素酶（半纤维素酶（Hem

32、icellulase），如），如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离;E 蜗牛酶（蜗牛酶（Snailase），是一种混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，），是一种混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等淀粉酶，蛋白酶等20多种酶主要用于体细胞原生质体分离。多种酶主要用于体细胞原生质体分离。 酶液配制：酶液配制： 需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl22H20(0. 1mmol/l一一10mo1l)及及KH2PO4 (0

33、. 75mmol/l)等渗透稳等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。定剂，以维持原生质体完整性。 酶液酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以分别以5.4及及5.8为宜；混合使用时为宜；混合使用时pH5.4-pH5.6为宜，降至为宜，降至48以下则原生质以下则原生质体破裂。酶液配制后需以体破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。菌法。 3原生质体分离及纯化原生质体分离及纯化（1）分离：）分离： 原生质体分离有机械法及酶消化法，前者产量极低而原生质体分离有机械法及酶消化法，

34、前者产量极低而不多用、后者又分不多用、后者又分步法及二步法。步法及二步法。 一步法是将材料在一步法是将材料在2l一一28用纤维素酶及果胶酶混合液一用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理次性处理224h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。纤维素酶脱壁而释放原生质体。（引自（引自K.-H. Neumann et al., Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Principles and Practice, Springer-V

35、erlag Berlin Heidelberg 2009）（3）纯化）纯化 需用不锈钢网或尼龙网需用不锈钢网或尼龙网(100目一目一400目目)滤除较大杂物后再洗涤纯化。滤除较大杂物后再洗涤纯化。 A. 离心法离心法: 原生质体混合物于原生质体混合物于500l000 rpm离心离心5min,吸去上层液，沉淀再用吸去上层液，沉淀再用与酶液具有相同糖浓度溶液反复洗涤与酶液具有相同糖浓度溶液反复洗涤3一一4次，最后用原生质体培养液洗涤备用；次，最后用原生质体培养液洗涤备用； B. 飘浮法飘浮法: 离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细胞时可用离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细胞时可用20

36、蔗糖离心，蔗糖离心，原生质体浮于液面碎片及老细胞沉降而得以纯化，但产量低，有时对原生质体造成损伤；原生质体浮于液面碎片及老细胞沉降而得以纯化，但产量低，有时对原生质体造成损伤； C. 界面法界面法: 利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理，将原生质体混合物置利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理，将原生质体混合物置于葡聚糖及于葡聚糖及PEG混合液中离心，即可从两相界面获得高纯度原生质体；混合液中离心，即可从两相界面获得高纯度原生质体； D. 滴洗法滴洗法: 原生质体混合物置于孔径原生质体混合物置于孔径8um滤器中，用洗液以滤器中，用洗液以l-2滴秒速度滴秒速度自然过滤洗涤，其过程勿使滤

37、干，洗至一定程度后，用原生质体培养液混合自然过滤洗涤，其过程勿使滤干，洗至一定程度后，用原生质体培养液混合备用。此法原生质体破碎少。备用。此法原生质体破碎少。Brassica leaves at the start and end of incubation in enzyme solutionLeaves slit into thinstrips and placed inenzyme solution Well digested leavesP ellet contains debrisTube after centrifugationof protoplasts with sucrose

38、Band of protoplastsClose-up of band of protoplasts floated up on sucrose 4原生质体活力测定原生质体活力测定 纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养测定方法有；纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养测定方法有；（1）根据形态待征判断其活力）根据形态待征判断其活力：来源于叶片的原生质体，呈绿色及圆：来源于叶片的原生质体，呈绿色及圆而鼓者为活原生质体；来源于愈伤组织及悬浮细胞者，胞质内原生质环流及布朗而鼓者为活原生质体；来源于愈伤组织及悬浮细胞者，胞质内原生质环流及布朗运动活跃者活力较高；运动活跃者活力较高；（2）活体染色

39、法）活体染色法：用：用0. 1酚番红或伊文思蓝染色、不着色者为活原生质酚番红或伊文思蓝染色、不着色者为活原生质体，染色者为无活力原生质体；体，染色者为无活力原生质体；（3）荧光染料活休染色法）荧光染料活休染色法：用双醋酸荧光素染色，染料可自由透过细：用双醋酸荧光素染色，染料可自由透过细胞膜，在细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而滞留胞膜，在细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原生质体死活。于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原生质体死活。5. 影响原生质体体产量和活力的因素：影响原生质体体产量和活力的因素：（1

40、）材料来源：选择幼嫩组织分离原生质体，或快速生）材料来源：选择幼嫩组织分离原生质体，或快速生长愈伤组织或对数期悬浮细胞。长愈伤组织或对数期悬浮细胞。（2）酶处理：酶的种类和浓度，处理时间，）酶处理：酶的种类和浓度，处理时间，pH等条件。等条件。（3）渗透稳定剂：酶液、原生质体清洗液和原生质体）渗透稳定剂：酶液、原生质体清洗液和原生质体培养液均需保持适当的渗透压。培养液均需保持适当的渗透压。（二）原生质体培养：（二）原生质体培养： 1. 培养方法：培养方法：（1）固体培养）固体培养：平板培养法，：平板培养法，1. 2%琼脂琼脂, 45 oC.（2）液体培养：）液体培养： A. 浅层培养法浅层培养

41、法: 其过程是将其过程是将1m1原生质体悬液置于直径原生质体悬液置于直径4cm培养皿或培养皿或25m1三角瓶三角瓶中使成薄层后于培养箱中培养初期振摇中使成薄层后于培养箱中培养初期振摇12次，防止粘壁；次，防止粘壁； B. 悬滴培养法悬滴培养法:其过程系将原生质体悬液滴入培养皿盖内，其量分别为其过程系将原生质体悬液滴入培养皿盖内，其量分别为5一一10、50100及及100一一200 ul等，保持一定滴距每皿由几滴至十几滴不等，培养皿加入浓度低于培养液的液等，保持一定滴距每皿由几滴至十几滴不等，培养皿加入浓度低于培养液的液体，再将皿盖翻盖于皿上并置培养箱中培养；体，再将皿盖翻盖于皿上并置培养箱中培

42、养； C. 双层培养法双层培养法: 先将固体培养基倾入培养皿内冷却成层，再将原生质体悬浮液先将固体培养基倾入培养皿内冷却成层，再将原生质体悬浮液置于已固化培养基上培养；置于已固化培养基上培养； D. 看护培养法看护培养法: 在培养皿底层铺一层正常密度且经射线处理已失去分裂能力而有代谢活力的原在培养皿底层铺一层正常密度且经射线处理已失去分裂能力而有代谢活力的原生质体琼脂混合物作饲养层，再于其上接种一层低密度生质体琼脂混合物作饲养层，再于其上接种一层低密度(5一一lo个细胞个细胞m1)悬浮原生质体培养。悬浮原生质体培养。原生质体培养常规方法与包埋球培养（图片引自原生质体培养常规方法与包埋球培养（图

43、片引自Plant Cell Reports，2007，26：719-725） 榆树原生质体分离及培养（图片引自榆树原生质体分离及培养（图片引自Plant Cell Tiss Organ Cult，2006, 86: 359366）2. 培养条件：培养条件： 密度：密度： 平板培养平板培养103104个个/ml, 液体培养液体培养104105个个/ml温度：温度： 多数为多数为25-28 oC, 少数少数1637 oC光照：光照：500 lx,18h 或或2800 lx 连续光照连续光照 多数要求多数要求 黑暗或弱光黑暗或弱光3. 细胞壁再生及细胞分裂：细胞壁再生及细胞分裂： l一一3天即再生新

44、细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用质壁分离法或在稍微低渗溶液中出芽现象证实。也可用质壁分离法或在稍微低渗溶液中出芽现象证实。也可用0. 1% ST型或型或WBL型型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。 在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围常在于泡质中

45、或围绕于细胞核周围常在1一一2周内发生第一次分裂。不同细胞分周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同，常在裂频率不同，常在190之间。之间。（引自（引自K.-H. Neumann et al., Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Principles and Practice, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2009）4. 愈伤组织形成及胚状体形成愈伤组织形成及胚状体形成 原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续生长：原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续生长： A .形

46、成细胞团，发育成愈伤组织；愈伤组织通过器官发生或体细胞形成细胞团，发育成愈伤组织；愈伤组织通过器官发生或体细胞配途径形成再生植株。配途径形成再生植株。 B. 形成胚状体，再产生植株；形成胚状体，再产生植株； 随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和组织培养相同，故培养随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和组织培养相同，故培养34周需添周需添加含一定量低渗稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细胞团及小愈伤组织加含一定量低渗稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细胞团及小愈伤组织的生长。的生长。 5. 植株再生植株再生 除少数植物通过胚状体直接发育成完整植株外，大多经愈伤组织除少数植物

47、通过胚状体直接发育成完整植株外，大多经愈伤组织诱导分化形成芽及根再生为完整植株。当愈伤组织达到诱导分化形成芽及根再生为完整植株。当愈伤组织达到12mm时，时，转移至分化培养基上诱导器官分化。分化培养基与原生质体培养基差转移至分化培养基上诱导器官分化。分化培养基与原生质体培养基差别在于：别在于： (1) 只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂；只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂； (2) 与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长素与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长素; (3) 在诱导器官分化过程中，一般采用在诱导器官分化过程中，一般采用15001x左右的高光强。诱导器官左右的高光强。诱导器官分

48、化的温度与原生质体培养基本相同。分化的温度与原生质体培养基本相同。 无根苗转移至诱导生根的培养基上培养生根，其只含低浓度生长素，而无根苗转移至诱导生根的培养基上培养生根，其只含低浓度生长素，而不含细胞分裂素，无根苗一旦生根即可发育成完整植株。不含细胞分裂素，无根苗一旦生根即可发育成完整植株。 在外界因素作用下，两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细在外界因素作用下，两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程称为植物细胞融合，或植物体细胞杂交。但由于植物细胞具胞的过程称为植物细胞融合，或植物体细胞杂交。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁释放出原生有坚硬的细胞壁

49、，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，形件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，形成完整植株。成完整植株。植物体细胞杂交的过程植物体细胞杂交的过程植物植物细胞细胞A A植物细植物细胞胞B B原生原生质体质体A A原生原生质体质体B B原生质原生质体融合体融合正在融合的正在融合的原生质体原生质体再生出再生出细胞壁细胞壁杂种杂种细胞细胞愈伤愈伤组织组织杂种杂种植株植株去掉细胞壁去掉细胞壁植物组织培

50、养植物组织培养植物细胞融合植物细胞融合特点：特点：(1) 可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合性；性；(2) 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广；异范围极广；(3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用一次操作可实现两个以上亲本的融合作用(4) 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；(5) 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；一、细胞融合技术 植物原生质体培养过程，有时无需任何处理

51、亦产生融合现象，为自发融合，但融合率极低。植物原生质体培养过程，有时无需任何处理亦产生融合现象，为自发融合，但融合率极低。异源原生质体融合需某种外力作用才能实现。异源原生质体融合需某种外力作用才能实现。1. 化学融合化学融合（1）盐类融合法：硝酸盐（如）盐类融合法：硝酸盐（如NaNO3）、氯化物（如氯化物（如NaCl等）等） 可中和原生质体表面可中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，可以用于融合，但融合率低；负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，可以用于融合，但融合率低；（2）高）高Ca2和高和高pH值诱导，如烟草叶肉原生质体于值诱导，如烟草叶肉原生质体于pH 10.5，0.05 mol/LCaCl2 培养基中，培养基中，37 保温，融合率可达保温，融合率可达25，并可获得杂种植株；，并可获得杂种植株； (3) PEG诱导，在高浓度诱导，在高浓度PEG溶液中，原生质体发生聚集作用，经稀释后，溶液中，原生质体发生聚集作用，经稀释后，50以上原以上原生质体发生融合作用，且对多种不同原生质体均有效；生质体发生融合作用，且对多种不同原生质体均有效； (4) 高高Ca2+、高、高pH值及值及PEG结合诱导法，此为方法结合诱导法，此