菊花的组织培养(第二课时)

1、菊花的组织培养菊花的组织培养制备制备MS固固体培养基体培养基外植体消毒外植体消毒接种接种培养培养栽培栽培实验具体操作过程实验具体操作过程移栽移栽实验具体操作过程实验具体操作过程（一）制备（一）制备MS固体培养基固体培养基 MS培养基包括培养基包括20多种多种营养成分，实验营养成分，实验室一般使用室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来保存配制好的培养基母液来制备。制备。1 1、配置各种母液、配置各种母液无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓倍，微量元素浓缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可

2、按一般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量实验具体操作过程实验具体操作过程2 2、配置培养基、配置培养基定容定容调调PHPH培养基的分装培养基的分装 实验具体操作过程实验具体操作过程实验具体操作过程实验具体操作过程3 3、灭菌、灭菌 分装好的培养基连同其他器械一起进行分装好的培养基连同其他器械一起进行高压高压蒸汽灭菌蒸汽灭菌。注意：注意：温度为温度为121时，维持时，维持15-20分钟。若灭菌时分钟。若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失

3、效。间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。某些生长调节剂如赤霉素等以及某些维生素某些生长调节剂如赤霉素等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行而需要进行过滤灭菌过滤灭菌。 实验具体操作过程实验具体操作过程1 1、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒（二）外植体消毒考虑的因素考虑的因素 说说 明明外植体的年龄外植体的年龄选择选择幼嫩的组织或器官幼嫩的组织或器官作为外植体作为外植体外植体的大小外植体的大小选择选择大小适中大小适中的作为外植体的作为外植体外植体所在部位外植体所在部位

4、选择选择芽尖、根尖或幼嫩的茎芽尖、根尖或幼嫩的茎作为外植体作为外植体外植体外观形态外植体外观形态 选择选择表面相对光滑易消毒表面相对光滑易消毒的作为外植体的作为外植体2 2、表面消毒、表面消毒流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min20min左右左右 酒精处理酒精处理无菌水冲洗无菌水冲洗用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次，持续次，持续6 67s7s，立即将外，立即

5、将外植体取出，在无菌水中清洗植体取出，在无菌水中清洗 氯化汞（升汞）氯化汞（升汞）无菌水冲洗无菌水冲洗取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为量分数为0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在无，取出后在无菌水中至少清洗菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂净消毒液消毒液实验具体操作过程实验具体操作过程流水冲洗流水冲洗实验具体操作过程实验具体操作过程实验具体操作过程实验具体操作过程（三）接种（三）接种1 1、接种室消毒、接种室消毒 污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室

6、消毒是至关重要的。用接种室消毒是至关重要的。用7070的酒精的酒精喷喷雾使空气消毒，酒精擦洗工作台并用紫外线雾使空气消毒，酒精擦洗工作台并用紫外线照射照射2020分钟。分钟。2 2、无菌操作要求、无菌操作要求 操作要在操作要在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁完成，每次使完成，每次使用器械后，都需要用用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌火焰灼烧灭菌，接种，接种后立即盖好瓶盖。后立即盖好瓶盖。实验具体操作过程实验具体操作过程 插入时应注意方向，插入时应注意方向，不要倒插不要倒插，茎段、茎，茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分。尖基部插入培养基利于吸收水分和养分。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种实

7、验具体操作过程实验具体操作过程进行外植体的接种进行外植体的接种 接种前用体积分数为接种前用体积分数为70%的酒精将工的酒精将工作台擦拭一遍，打开紫外灯照射作台擦拭一遍，打开紫外灯照射20分钟。分钟。工作台消毒后，首先点燃酒精灯。工作台消毒后，首先点燃酒精灯。酒精摇动酒精摇动倾倒酒精倾倒酒精无菌水冲洗无菌水冲洗升汞消毒升汞消毒倾倒升汞倾倒升汞无菌水冲洗无菌水冲洗特别提醒：特别提醒：接种过程必须始终在酒精灯旁进接种过程必须始终在酒精灯旁进行，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭行，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，操作过程中避免双手从培养皿上方移动。菌，操作过程中避免双手从培养皿上方移动。特别提

8、醒：特别提醒：每瓶内接种材料不宜过多（建议每瓶内接种材料不宜过多（建议4-5个），彼此之间留出一定空间，从而避个），彼此之间留出一定空间，从而避免互相污染。免互相污染。思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？验吗？ 每种材料或配方至少要做一组以上的重复。每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。染。实验具体操作过

9、程实验具体操作过程实验具体操作过程实验具体操作过程（四）培养（四）培养无菌箱中培养，定期消毒，保持适宜的温度，无菌箱中培养，定期消毒，保持适宜的温度，光照光照接种后的锥形瓶放在培接种后的锥形瓶放在培 养箱或培养室中培养。养箱或培养室中培养。培养条件：培养条件：18-22， 每日光照每日光照12小时小时。实验结果实验结果5-7天，外植体膨胀、生长，颜色变浅，天，外植体膨胀、生长，颜色变浅，若出现染菌，及时转瓶。若出现染菌，及时转瓶。实验结果实验结果2-3周，愈伤组织开始形成。周，愈伤组织开始形成。染菌染菌5-75-7天后天后染菌染菌1-21-2周后周后实验结果实验结果3-5周之后，诱导出的新叶片

10、和芽。周之后，诱导出的新叶片和芽。实验具体操作过程实验具体操作过程（五）移栽（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1 1、打开封口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间实验具体操作过程实验具体操作过程珍珠岩：珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性 好，适合栽培。好，适合栽培。蛭石蛭石

11、是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。其晶体结构为单斜晶系，从外形上它看上去像云母。其晶体结构为单斜晶系，从外形上它看上去像云母。蛭石是一定的花岗岩水合时产生的。它一般与石棉同蛭石是一定的花岗岩水合时产生的。它一般与石棉同时产生。由于蛭石有离子交换的能力，它对土壤的营时产生。由于蛭石有离子交换的能力，它对土壤的营养有极大的作用。养有极大的作用。 蛭石的化学式为（蛭石的化学式为（Mg，Ca）0.7（Mg，Fe，Al）6.0（Al，Si）8.0（OH4.8H2O

12、）。）。实验具体操作过程实验具体操作过程（六）栽培（六）栽培幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花况，适时浇水、施肥，直至开花幼苗的移栽和栽培幼苗的移栽和栽培无菌条件如何保证？无菌条件如何保证？需要保证无菌需要保证无菌条件步骤条件步骤关键操作关键操作培养基及实验培养基及实验器材的灭菌器材的灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌灭菌干燥后直接拿到无菌操作台中灭菌干燥后直接拿到无菌操作台中外植体的消毒外植体的消毒酒精、酒精、升升汞汞、无菌水彻底清洗无菌水彻底清洗接种的接种的无菌操作无菌操作始终在酒精灯旁进行始终在酒精灯旁进行每次使用器械后，都需要浸泡在每次使用器械后，都需要浸泡在95%的酒精中的酒精中每次使用器械前，都需要用火焰灼烧灭菌每次使用器械前，都需要用火焰灼烧灭菌操作过程中避免双手从培养皿上方移动操作过程中避免双手从培养皿上方移动每瓶内接种材料不宜过多每瓶内接种材料不宜过多培养箱培养箱中的培中的培养养观察时不打开封口膜观察时不打开封口膜手持锥形瓶锥形瓶观察时正握手持锥形瓶锥形瓶观察时正握发现染菌外植体，