紫外线对枯草芽孢杆菌诱变

1、紫外线诱导枯草芽孢杆紫外线诱导枯草芽孢杆 菌突变菌突变 第六组小组成员第六组小组成员 实验目的：实验目的：学习微生物诱变育种的基本操作方法学习微生物诱变育种的基本操作方法实验内容：实验内容：1：对枯草芽孢杆菌出发菌株进行处理：对枯草芽孢杆菌出发菌株进行处理制备菌悬液。制备菌悬液。2：对紫外线进行诱变处理。：对紫外线进行诱变处理。实验材料和用具1 菌种:枯草芽孢杆菌2 培养基:淀粉培养基。3 主要药品:牛肉膏、蛋白胨、Nacl、可溶性淀粉、碘液，生理盐水。4主要器皿:试管、移液管、锥形瓶、量筒、烧杯、紫外灯、离心机、培养皿等。技术路线：材料器具准备菌悬液制备平板制作紫外线诱变处理稀释菌悬液稀释涂

2、平板计算存活率及致死率操作步骤1.菌悬液制备将枯草芽孢杆菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，37培养20h，使其活化，取已培养20 h 的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，倒入离心管中，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。2. 平板制作将培养基熔化后，冷至45左右倒平板。3诱变处理用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验用紫外线照射的诱变方法。(1)紫外线处理 打开紫外灯预热20mi

3、n。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗中保存12h 然后稀释涂菌进行初筛。(2)稀释菌悬液 按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30恒温培养23d。4稀释涂平板 取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5 mL 进行不同

4、程度的稀释。取最后3 个稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，培养48 h(用报纸包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度。注：枯草芽孢杆菌诱变前：稀释至10-8，10-7,10-6，生理盐水枯草芽孢杆菌照射1min稀释至10-8,10-7,10-6，生理盐水枯草芽孢杆菌照射2min稀释至10-8,10-7，10-6，生理盐水枯草芽孢杆菌照射3min稀释至10-8，10 存活率将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。 同样计算用紫外线处理1、2、3min 后的存活细胞数及致死

5、率。注 意 事 项1：紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。2：诱变过程及诱变后的稀释操作在无菌下进行并黑暗中培养。 实验结果分析实验结论：实验失败失败原因分析：细节决定成败1：制作牛肉膏蛋白胨培养基时，没有调到合适的PH。2：培养基灭菌处理没有处理好，导致杂菌没有灭干净。3：接种过程中由于在酒精灯上灼烧时间长且没有完全冷却就进行接种导致菌种被烫死。培养基培养时没有长出实验中所需菌落。失败原因4：紫外线诱变过程及诱变后的稀释操作没有在无菌下进行，在黑暗中培养时间过短。5：涂平板时离酒精灯远进，导致杂菌进入，最后菌落没有长出，且其他杂菌生长旺盛。6：由于以上所有操作都应无菌操作进行，但实际操作没有做到

6、无菌操作，最后导致平板上菌落较杂，分不清枯草芽孢杆菌菌落无法计数。教训1：实验操作提前准备：实验操作提前准备 材料及器材。材料及器材。2：无菌操作时严格：无菌操作时严格 按照无菌操作按照无菌操作 技术操作。技术操作。3 3：紫外线诱变处：紫外线诱变处 理时注意黑暗理时注意黑暗 培养。培养。4：遇到不会的要：遇到不会的要及时询问，不能及时询问，不能自己随便做。自己随便做。参考文献：参考文献：1李豪，车振明.微波诱变微生物育种的研究J.山西食品工业，2005,6（2）.简要概括了国内外微波诱变育种领域的研究新进展，对微波的生物学效应及诱变微生物的机理进行了总结和讨论，在此基础上探讨了微波诱变微生物

7、育种的应用性研究。最后，对本领域的发展进行了展望。2孙金旭.乳酒酵母紫外诱变原生质体制备研究J.酿酒科技，2008（6）.在乳酒酵母原生质体形成率和再生率影响单因素研究的基础上，对菌龄、酵解温度、酵解时间、酶浓度、稳渗剂采用L16（4）5正交试验，评价各因素的影响程度，得出适宜该菌原生质体制备的条件。33周德明，冯友仁，梁帅周德明，冯友仁，梁帅. .木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶高产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶高产菌株的诱变育种菌株的诱变育种J.J.中国林业科技大学学报，中国林业科技大学学报，2009,102009,10（5 5）. .利用低能利用低能N N 注入，对产木质素过氧化物酶注入，

8、对产木质素过氧化物酶(Mnp)(Mnp)和锰过氧化物酶和锰过氧化物酶(Lip)(Lip)活力均较高的菌株活力均较高的菌株N1023N1023进行诱变，研究了不同能量和不同剂量进行诱变，研究了不同能量和不同剂量N+N+离离子诱变后菌株的存活率与突变率、突变菌株的产酶活力及遗传稳定子诱变后菌株的存活率与突变率、突变菌株的产酶活力及遗传稳定性结果表明：不同能量和不同性结果表明：不同能量和不同N N 离子剂量注入对菌株有显著影响，离子剂量注入对菌株有显著影响，诱变菌株诱变菌株Nlo23jNlo23j产产Mnp11LipMnp11Lip双酶活力分别提高了双酶活力分别提高了27272929和和222258

9、58，同时诱变菌株，同时诱变菌株N1o23jN1o23j有很好的遗传稳定性有很好的遗传稳定性。44孟庆云，张鹏孟庆云，张鹏. .环境参数变化对环境参数变化对射线诱变微生物的影响射线诱变微生物的影响J.J.微微生物学通报，生物学通报，2000,272000,27（3 3）. .报告了在非自然环境中培养选育青霉菌苗株的一些结论。实验表明报告了在非自然环境中培养选育青霉菌苗株的一些结论。实验表明随着辐射剂量的增加菌株的致死率也相应增加；当辐照剂量相同时，随着辐射剂量的增加菌株的致死率也相应增加；当辐照剂量相同时，与自然环境相比其致死率有所提高，且随着非自然环境参数值的增与自然环境相比其致死率有所提高

10、，且随着非自然环境参数值的增加而增加。当电场强度为加而增加。当电场强度为300kV300kVm m、磁场强度为、磁场强度为600G600G时，正变率有时，正变率有一极大值。一极大值。5娄权，陈广平.浸矿微生物紫外诱变选育及浸矿机理研究J.现代矿业，2004（2）.通过微生物的铜离子耐受性培养，选取可以浸出铜离子的酸性浸矿微生物，并利用紫外线照射对微生物进行诱变培养，培育出一种可以高效浸出铜离子的酸性浸矿微生物。同时探讨了微生物对铜离子的耐受性培育和紫外线诱变在高效浸矿微生物选育中的应用，以及浸矿微生物在矿山中的应用前景。6丁学知，夏立秋.苏云金杆菌高毒力菌株4.0718的快速选育J.中国生物防

11、治，2001,17（4）63-166.不同生态区域的早作地、果园和稻田采集的858份土样中，分离筛选出苏云垒杆菌30株选取一株具典型苏云垒杆菌菌落特征和较高杀虫毒力的菌株70为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变，显微涂片染色镜检，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量及芽孢与伴孢晶体的比倒与杀虫效力密切相关以这些特征为参考进行一佚速韧筛和毒力生测复筛，筛选出一株高毒力突变杀虫菌株40718。该突变袜杀虫毒力与原始菌株相比提高了75倍，在6、12和24h内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达20、97和100此菌株的高效速效杀虫毒力经连续l0代培养能稳定遗传。7石磊，梁运章.物理因子对微生

12、物诱变作用的研究进展J.内蒙古大学学报（自然科学版），2006,1（1）.微生物与食品卫生、医药健康、生态环境、资源使用、农畜牧业等方面息息相关。用于工业生产上的微生物主要是从自然界筛选或选育的，为了获得优质、高产、低耗的工业微生物，人们采用各种物理因子对微生物进行诱变处理的试验研究，并获得成功，其中有些经诱变的微生物菌株应用于工农业生产中。介绍了近几年人们用激光、电磁波、离子束等几种物理因子对微生物进行处理得到的一些研究成果及基本机理分析。8贾啸静.微生物药物产生菌诱变育种方法的应用和进展J.河北省科学院学报，2006,23（3）.产微生物药物的原始菌株往往产量较低,为满足工业生产的需要,需要通过合适的诱变育种方法进行改良。详细介绍了目前较为通用的几种物理和化学诱变育种技术及其应用情况,同时简述了获得高产突变株的几种筛选方式。9许翠，高梦祥.微生物菌种诱变筛选方法及其应用J.长江大学学报（自然科学版），2013,35（12）.野生微生物菌株的代谢产物的产量通常很低，不能满足工业生产的需求，因此简单高效、定向稳定的微生物菌种诱变技术和快速、有效的高通量筛选方法在微生物菌种选育中显得至关重要。综述了近年来国内外微生物菌种诱变筛选领域出现的新技术和新方法，可为微生物菌种诱变筛选等相关研究提供参考。10王雅参君，陈力力，