医学细胞生物学设计型实验——细胞核的分离与鉴定

1、成员：彭英、向欢欢、令狐琪琦、杨秀麟、敬成员：彭英、向欢欢、令狐琪琦、杨秀麟、敬昱宸、李明先昱宸、李明先第一大组第一大组细胞破碎的方法细胞破碎的方法实验原理实验原理一、分离细胞质与细胞核一、分离细胞质与细胞核细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定. .破碎细胞破碎细胞机械法机械法 物理法物理法化学法化学法高速组织捣碎机高速组织捣碎机玻璃匀浆器玻璃匀浆器（匀浆）（匀浆）研钵研钵超声匀浆器超声匀浆器冻融法冻融法自溶法自溶法表面活性剂处理法表面活性剂处理法酶处理酶处理细胞核的分离和鉴定 在在低温低温下，将组织块放入下，将组织块放入匀浆器，匀浆器，加入加入等渗浆介质等渗浆介质进行研磨，破碎细胞，进行研磨

2、，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。浆液。匀浆：匀浆：.离心技术离心技术细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心，将细胞各种组常用不同介质和不同转速的离心，将细胞各种组分分级分离出来分分级分离出来( (cell fractionationcell fractionation) )。组织细胞匀浆组织细胞匀浆分级分离分级分离分析分析细胞核的分离和鉴定细胞核的分

3、离和鉴定离离 心心 方方 法法差速沉降离心法差速沉降离心法 速率区带离心法速率区带离心法等密度区带离心法等密度区带离心法密度梯度区密度梯度区带离心法带离心法 差速离心差速离心differential centrifugationdifferential centrifugation细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定加速加速 低速低速高速高速差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为差较大（一般为1010倍）的颗粒。倍）的颗粒。细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定实验步骤：实验步骤：1 1、 颈椎脱臼法颈椎脱臼法处死小白鼠。迅速开腹取肝，在盛有处死小

4、白鼠。迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤。生理盐水的小烧杯中反复洗涤。2 2、称取湿重约、称取湿重约1g1g的肝组织，量取的肝组织，量取8ml8ml预冷的匀浆缓冲预冷的匀浆缓冲液（液（0.25mol/L0.25mol/L蔗糖蔗糖-0.003mol/L-0.003mol/L氯化钙溶液）并加氯化钙溶液）并加入烧杯中，尽量剪碎肝组织。入烧杯中，尽量剪碎肝组织。3 3、将剪碎的肝组织倒入匀浆器匀浆、将剪碎的肝组织倒入匀浆器匀浆（匀浆器下段浸（匀浆器下段浸 入盛有冰块的小烧杯中保持低温）入盛有冰块的小烧杯中保持低温），捣毁组织，直，捣毁组织，直至看不到明显的组织块。至看不到明显的组织块。细胞

5、核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定4 4、匀浆彻底后，、匀浆彻底后，8 8层纱布过滤层纱布过滤（先用少量匀浆缓冲液润（先用少量匀浆缓冲液润湿纱布）湿纱布），滤液转移至玻璃离心管中。，滤液转移至玻璃离心管中。5 5、平衡离心管，离心、平衡离心管，离心15min(2500r/min),15min(2500r/min),将上清移入将上清移入另一玻璃离心管中。取上清液制一张涂片另一玻璃离心管中。取上清液制一张涂片, ,残余约残余约1ml1ml液体将沉淀吹打均匀制成悬浊液，制另一张涂片液体将沉淀吹打均匀制成悬浊液，制另一张涂片 ，自然干燥。，自然干燥。6 6、将涂片、用、将涂片、用甲苯胺蓝甲苯胺蓝染色染色

6、10min10min，冲去染液晾，冲去染液晾干后，在显微镜下观察。干后，在显微镜下观察。 甲苯胺蓝甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺属于醌亚胺染料类染料类,这类染料一般含有两个发色团这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基一个是胺基,一个是醌型苯环一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团来构成色原显色。染料除有发色团外外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类类,帮助发色团对组织产生染色力帮助发色团对组织产生染色力,

7、使切片上的组织使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两还含有两个助色团个助色团,为碱性染料为碱性染料, ,因此可以和组织细胞的酸性因此可以和组织细胞的酸性物质结合而使其染色。即可染细胞核使之呈蓝色。物质结合而使其染色。即可染细胞核使之呈蓝色。 另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用性物质遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用于肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。于肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。 细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定预期结果：预期结果

8、：细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定 低倍镜下找到标本，再换到高倍镜，低倍镜下找到标本，再换到高倍镜，可见肝细胞的细胞核已经游离出来，圆形，可见肝细胞的细胞核已经游离出来，圆形，被染成蓝紫色，核仁有被染成蓝紫色，核仁有2 2到到4 4个。个。实验用品实验用品细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定 材料：小白鼠肝脏材料：小白鼠肝脏 试剂：生理盐水、试剂：生理盐水、0.25mol/L0.25mol/L蔗糖蔗糖- -0.003mol/L0.003mol/L氯化钙溶液、氯化钙溶液、1%1%甲苯胺蓝染液。甲苯胺蓝染液。 仪器设备：显微镜、普通离心机、天平、仪器设备：显微镜、普通离心机、天平、离心管、滴管

9、、玻璃漏斗、量筒、离心管、滴管、玻璃漏斗、量筒、2525毫升毫升烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、玻烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、玻璃匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架。璃匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架。注意事项：注意事项：细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定（1 1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。（2 2）将匀浆液过滤于离心管中后应及时离心，以）将匀浆液过滤于离心管中后应及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。心分层效果。（3 3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。厚。（4 4）染色后的洗涤要注意时间