小鼠气、血、阴、阳、虚等八种模型四诊的比较和评价

1、上海市卫生局资助项目,项目编号:2004J003A 通讯作者:方肇勤 T :021-*小鼠气、血、阴、阳、虚等八种模型四诊的比较和评价卢文丽 方肇勤 潘志强 付晓伶(上海中医药大学实验中医学教研室,上海 201203摘要:为了观察常见小鼠虚证模型四诊表现的异同,及其模型的可靠性,我们依据文献,分别制作了气血阴阳各两种共8个虚证模型,通过同步检测体重、饮水、摄食、肛温、尾温、心率及爪、尾显微放大拍照及图像处理得到r 值,对各虚证各模型四诊进行比较。初步研究表明,在气虚方面,环膦酰胺模型属脾阳气虚,可能还伴随血虚和肾虚;番泻叶模型大体为腹泻伤津模型,而脾气虚不是主要的;在血虚方面,乙酰苯肼模型为血

2、虚模型;而尾静脉放血至血虚模型,需要延长造模时间、增加放血的次数和数量;在阴虚方面,甲状腺素模型属阳热偏盛,阴虚不突出;氢化可的松阴虚模型,接近于阴虚;在阳虚方面,丙基硫氧嘧啶阳虚模型可能要求造模剂量增大和时间延长;而氢化可的松阳虚模型不甚典型。关键词:气虚;血虚;阴虚;阳虚;动物模型;小鼠在以往的研究中,虚证的报道是最多和最集中的,其中还初步涉及到小鼠四诊客观化的研究,证实小鼠有证可辨1-3。但以往的文献报道更多是单独就单一证型或单一模型进行研究,缺少多模型多证型的同步比较,模型的可靠性也缺乏验证与评估,给证侯和辨证论治的基础研究提出了新的要求。因此,为能更好的评价常见虚证实验动物模型,找出

3、相对稳定、敏感的检测指标,推动小鼠四诊客观化工作的进一步开展,我们进行了本实验。1 材料和方法 1.1实验动物清洁级昆明小鼠,18-20g ,雄性,90只,由上海中医药大学实验动物中心提供,动物合格证号:scxk(沪:2003-0003。完全随机分为9组。1.2仪器与设备MP200B 型电子天平,XD-7100单道心电图机,自制小鼠心电采集装置,数字WMY-01型温度计,SQF-EA 体视显微镜,3200K (色温500W 摄像专用光源,自制光源装置,NIKON Coolpix4500数码相机,Photoshop7.0图像软件。1.3造模方法在归纳整理以往的文献报道的基础上,气血阴阳四虚证各选

4、取两种模型,具体如下表: 证型 造模和处理方法 模型起 止时间出处正常组 不作任何处理环瞵酰胺气虚 环瞵酰胺注射液1mg/10g ,腹腔注射,第1、2天各一次10-14 4 番泻叶气虚 番泻叶水煎剂0.25g/10g ,灌胃,一天一次,8天8-14 5-6 乙酰苯肼血虚 乙酰苯肼6mg/只,皮下注射,第1、4天各一次10-14 8 尾静脉放血血虚 多次尾静脉放血,第1、3、5天各一次10-14 9 甲状腺素阴虚 甲状腺素混悬液3 mg /10g 灌胃,一天一次,7天8-14 10 氢化可的松阴虚 氢化可的松注射液1mg/10g ,皮下注射, 一天一次,4天 10-14 11丙基硫氧嘧啶阳虚 丙

5、基硫氧嘧啶混悬液0.6mg/10g 灌胃,一天一次,14天1-14 12 氢化可的松阳虚 氢化可的松注射液0.25mg/10g 腹腔注射,一天一次,7天 8-14 13 实验共21天:依据造模长短时间不同,造模起始时间不相一致,但保证第14天全部造模结束,第15-21天为造模结束后(模型形成后的统一观察时间。期间共检测六次,分别为第1、8、10、15、18、21日。1.4检测指标一般指标:体重、饮水、摄食、肛温、尾温、爪和尾显微放大拍照和图像处理后的r 值。 1.5 检测方法第一步:采用Photoshop7.0图像软件进行图像处理,选取爪的掌部及尾部作为RGB 色度的定量分析。作为国际标准色的

6、定量,R 代表红色,G 代表绿色,B 代表蓝色,得到原始爪尾 RGB 14。第二步:校正不同检测批次间可能存在的采集条件误差。将第1批正常组小鼠爪R 的平均值,记为RN1,第2次正常组小鼠爪R 的平均值,记为RN2;RN2/ RN1得到一系数,以此系数校正第2批各小鼠。其它各批次每只小鼠依次以RN1分别校正处理。第三步:校正随机分组后客观存在的不同组别个体的差异。取第1批90只小鼠检测到的爪R 值的平均数,记为RT ,同时计算出第1批9个组各自爪R 平均值记为R1,R2R9,分别求出RT/ R1,RT/R2RT/R9等9个校正系数,在以上第二步校正的基础上,分别以这初始的9个校正系数分别校正各

7、自对应组别内以后各次检测所得的小鼠数据(各组第二步校正后的数值均除以各组对应的校正系数。第四步:爪G 、B ,尾R 、G 、B 以次类推,得出校正后的爪尾RGB 值。第五步:将校正后的RGB 值带入公式BG R Rr +=得出校正后的r 值。1.6数据处理方法除饮水摄食外,其它均采用方差分析,方差不齐采用非参检验。2 结果与评价2.1环磷酰胺与番泻叶气虚模型 图1不同气虚造模对体重的影响 图2不同气虚造模对肛温的影响 图3不同气虚造模对饮水量的影响图4不同气虚造模对摄食量的影响 图5不同气虚造模对爪r值的影响图6不同气虚造模对尾r值的影响环膦酰胺造模后动物表现为皮毛蓬松,易于捕捉,摄食量、肛温

8、下降。爪、尾反映红色程度的r值下降,且持续时间长。提示有明显的气虚与阳虚,脏腑定位主要在脾,是脾气虚、脾阳虚。至于爪色淡,爪、尾r值下降,可能部分属血虚所为;此外,以往药理实验提示有骨髓抑制,是否还与肾虚有关,有待进一步验证。番泻叶模型造模后动物自主活动减少,易于捕捉。造模后约1小时,即出现腹泻,肛周有污物。但是,动物造模后饮水增多;且爪、尾反映红色程度的r值均上升,不似通常脾气虚出现爪色淡、饮水减少的表现。肛温下降原因可能有二:一是番泻叶药性偏寒,二是大量腹泻,因此,具有外来寒邪致病的特点,再鉴于其恢复快,也不似遗传、体质或慢性疾病脾气虚、脾阳虚的表现,最多也就是一过性的伤阳。而且,小鼠对番

9、泻叶造模的适应性强,耐受性形成快。综合这样的表现,可以推测,采用本实验方法,番泻叶所造成的模型大体为腹泻伤津模型,脾气虚不是主要的。因此,作为脾气虚模型,采用番泻叶短期造模的价值不大。2.2乙酰苯肼与尾静脉放血血虚模型 图7 不同血虚造模对体重的影响图8 不同血虚造模对肛温的影响 图9 不同血虚造模对饮水量的影响图10 不同血虚造模对摄食量的影响 图11 不同血虚造模对爪r值的影响图12 不同血虚造模对尾r值的影响乙酰苯肼模型,动物外观十分虚弱,嗜卧,扎堆明显(畏寒,肛温下降,体重与饮水、摄食均下降;爪色明显改变,爪色淡,爪、尾反映红色程度的r值下降。造模结束后动物逐渐出现死亡,推测为剂量偏大

10、所致。肉眼所见爪色伴有一定程度的青紫,是小鼠爪色淡的特殊表现,还是血虚同时伴有血瘀,值得进一步研究。联系到以往我们观察到乙酰苯肼造血虚模型小鼠红血球显著破坏,因此,乙酰苯肼所造的模型可以肯定地讲为血虚模型。至于嗜卧、扎堆(畏寒,肛温下降,体重、饮水、摄食下降,爪色淡而青紫等一派阳气虚的表现,可能是大量血细胞破坏和乙酰苯肼大剂量的中毒“气不附血”的表现,需要进一步的观察。连续5天、共计3次的放血,难以造成小鼠典型的血虚模型,虽然模型小鼠肛温有下降趋势,典型的反映血虚的爪、尾未见明显的色泽改变,爪r值有下降趋势,尾r值则相反。总之,结合小鼠肛温、爪、尾等改变,这样的造模力度,小鼠尚处于有效代偿阶段

11、,而体质的下降已初见端倪。因此,适当延长造模时间、增加放血的次数和数量,可能会成为比较好的模拟失血性血虚模型。从造模的角度看,乙酰苯肼模型造模方便、时间短,变化明显而肯定,易于观察,易于捕捉规律,是一个比较理想的血虚模型。2.3甲状腺素和氢化可的松阴虚模型 图13 不同阴虚造模对体重的影响图14 不同阴虚造模对肛温的影响 图15不同阴虚造模对饮水量的影响图16不同阴虚造模对摄食量的影响 图17 不同阴虚造模对爪r值的影响图18不同阴虚造模对尾r值的影响甲状腺素模型造模后动物活动度增加,有轻微的躁动;饮水量上升明显,肛温有升高趋势;但是体重却未见下降、摄食量增加,爪、尾色泽未见明显变化,甚至反映

12、红色程度的爪、尾r值还出现下降。综合以上表现,这样的造模所形成的不是阴虚模型,而是阳热偏盛,火不旺(红色的表现阙如的模型。延长造模时间,可能会见到类似于临床的甲亢阴虚模型。氢化可的松造模后,动物饮水摄食略有上升,体重下降,爪、尾反映红色程度的r值上升,有类似于阴虚的表现。但是,动物外在行为表现与正常组比较未见明显差异,而且肛温有下降的趋势,用阴虚难以解释。总之本模型是一个比较接近阴虚的模型。相比之下,本实验所造的两个模型,均不是十分典型。就造模时间看,氢化可的松造模时间短,要方便一些。同时发展其他稳定、方便的阴虚动物模型应该是今后的方向之一。2.4丙基硫氧嘧啶与氢化可的松阳虚模型 图19 不同

13、阳虚造模对体重的影响图20 不同阳虚造模对肛温的影响血模型比较麻烦，小鼠的代偿能力强。短期甲状腺素模型只能是阳盛模型，并非阴虚；氢化可的 松剂量的偏差可以导致不同的证型。丙基硫氧嘧啶模型推测需要较长的造模时间。而在我们前期 的文献调查中15-18，这些模型的评价还是比较好的。因此，中医虚证证侯动物模型的摸索和建立， 还有很多工作要做。 在四诊检测指标方面，爪、尾图像指标 r 值和饮水、摄食及体重的变化比较稳定，而尾温和 心率次之。就检测指标的灵敏性而言，爪较尾为灵敏。 在我们以往的研究中，通过显微照片肉眼识别和图象处理相结合的判别，发现 R 的相对值 r （即 R 与 R、G、B 总和的百分比

14、）能够比较客观地反应小鼠爪色的红的程度，r 值越大，爪色越 红，r 值越小，爪色越淡19-23，在本次实验血虚模型中再次得到了验证。 中医药基础实验，要求符合中医的理论与实践，我们采用四诊合参，以及同步比较不同虚证 造模的异同，达到了预期目的，结论也相对可靠。遵循这种思路与方法，希望能更准确地建立和 评价不同证侯的动物模型，给辨证论治基础研究奠定坚实的基础。 参 考 文 献 方肇勤.中医基础证的一原三维研究J.中国中西医结合杂志, 2002,22(4: 250-251. 方肇勤. 开拓证研究新途径的思考J.上海中医药杂志, 2001, (4: 4-5. 陈晓,陈德溯,方肇勤. 荷瘤小鼠非创伤性

15、辨证指标的对照研究J.中医杂志, 2003,44(1: 58-59. 王禾 , 吉惠敏 , 韩立君 , 等 . 环磷酰胺模型中医证型属性的实验研究 J. 中国中医基础医学杂 志,1996,2(5:46-49 5 李传英等.脾虚泄泻证动物模型的研究J.浙江中医杂志,1982,17(8:355-357 6 刘 劲 , 曲 长 江 . 三 种 脾 虚 模 型 小 鼠 线 粒 体 超 微 结 构 改 变 的 比 较 研 究 J 中 医 药 学 刊,2001,19:378-379 7 陈家旭,陈易新,季绍良,等.泻下、劳倦因素致脾气虚大鼠下丘脑、血浆 NPY 含量的变化J.北 京中医药大学学报,2002

16、,25(6:22-24 8 贲长恩. 血虚动物模型初讨J.上海中医药杂志, 1981,(6:38-39 9 陈奇.中药原理研究方法学M.北京.人民卫生出版社,1993.9:1010 10 李发荣,徐文友,曹永孝.太白参对甲亢型肾阴虚小鼠的影响J.中药材,2001,24(3:190-191 11 夏洪生,张永锋,刘立昌,等归蓉补血片对小鼠阴虚证模型作用的实验研究J.湖北中医学院学 报.2001, 3(2:23-24 12 秦 路 平 , 石汉 平 .Osthol 和 Icariin 对 甲 减 小 鼠 血 清 甲 状腺 素 的影 响 J. 第 二军 医 大 学学 报,1998,19(1: 48-

17、50 13 史万玉,程书梅,包永占.小白鼠氢化可的松阳虚模型的剂量选择J.中兽医杂志 1996,(5:15. 14 贾云得编著, 机器视觉, M科学出版社, 2000,150-159. 15 潘志强,方肇勤.小鼠虚证模型实验研究现状及发展趋势J.上海中医药大学学报,2003,17(4: 60-63 16 付晓伶,方肇勤.阴虚证动物模型的造模方法及评析J.上海中医药大学学报,2004,18(2:51-54 17 李军兰,方肇勤.气虚证动物模型造模方法综述J.上海中医药大学学报, 2004,18(3:56-60 18 卢文丽,方肇勤.阳虚证动物模型的造模方法与评析J.上海中医药大学学报,2004,18(4:44-48 19 陈德溯,陈晓,方肇勤. 建立荷瘤小鼠分期辨证方法的初步研究J.中国医药学报,2002,17(增 刊: