和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响(一)

1、和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响(一)作者：李永民，王保和 邢立强，薄爱华， 吴迎爽，周宁【摘要】 目的观察和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法以皮下大量注射异丙肾上腺素（ISO）的方法制备慢性心衰大鼠模型，随机分为模型对照组，卡托普利组，参麦注射液组，和营安心大、中、小剂量组。另设正常对照组，用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，用免疫组化方法检测心肌细胞Bax，Bcl2蛋白表达，计算Bcl2/Bax比值。结果模型对照组TUNEL法心肌细胞凋亡严重，棕褐色细胞核明显增多，免疫组化图像分析Bax表达明显升高，Bcl2，Bcl2/Bax比值明显下降。与模型对照组比较，和营安心方组

2、心肌细胞凋亡数量明显减少，Bax蛋白表达明显下降，Bcl2，Bcl2/Bax比值明显升高。结论和营安心方有减抑慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的作用。 【关键词】 和营安心方； 心力衰竭； 细胞凋亡； 血流动力学Abstract：ObjectiveTo study the effects of Heyingansxin Fang on myocardial apoptosis in chronic congestive heart failure rats.MethodsAnimal model of heart failure was induced by subcutaneously inject

3、ing large dose of ISO and the rats were randomly divided into model group， captopril group，Shenmai injection group， high dosage of Heyinganxin Fang， middle dosage of Heyinganxin Fang ， small dosage of Heyinganxin Fang and normal group. Apoptosis was detected with TUNEL .The Bax and Bcl-2 proteins of

4、 cardiomyocyte were detected with immunohistochemistry and Bcl-2/Bax ratio was calculated.ResultsCompared with normal group， apoptotic cells and brown cell nucleus increased significantly in model group，the expression of Bax increased but the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax ratio decreased signifi

5、cantly. Compared with model group， apoptotic cells decreased significantly in Heyinganxin Fang group，expression of Bax decreased and the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax ratio increased significantly.ConclusionHeyinganxin Fang has effect of inhibiting myocardial apoptosis in chronic congestive hear

6、t failure rats.Key words：Heyinganxin Fang; Congestive heart failure; Apoptosis; Hemodynamics慢性心衰属于虚劳“心损”的范畴，难经认为“损其心者，调其营卫”，我们宗难经之旨，确立了“调和营卫、化淤利水”的慢性心衰治则，组成和营安心方。本实验观察了和营安心方对慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响。1 材料与方法1.1 材料雄性Wistar大鼠70只，体重200240 g，购自河北省实验动物中心；和营安心方由西洋参6 g，玉竹15 g，云茯苓15 g，桂枝15 g，丹参20 g等组成，中剂量组水煎浓缩为11煎液（每

7、毫升含生药1 g）、大剂量组为12煎液（每毫升含生药2 g）、小剂量组为21煎液（每毫升含生药0.5 g），药物购自北京同仁堂药店；盐酸异丙肾上腺素注射液，2 ml1 mg/支，上海禾丰制药有限公司；卡托普利，25 mg/片，常州制药厂有限公司；参麦注射液，10 ml/支，河北神威药业有限公司；MK1020原位细胞凋亡检测试剂盒，武汉博士德生物工程公司；Bax，Bcl-2一抗，二步法TV6001免疫组化检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术公司。1.2 方法 在参考文献的基础上1，2，略加改进并经预实验证实，采取皮下多点注射异丙肾上腺素（ISO）的方法，第1天按20 mg/kg，第2天按10 mg/

8、kg，第312天按5 mg/kg的剂量连续皮下给药，另取11只大鼠为正常对照组，皮下注射等量蒸馏水。造模结束后随机取2只正常大鼠、5只造模大鼠测定血流动力学指标，两组指标差异明显，确认模型制备成功。造模大鼠随机分为模型对照组，参麦注射液组，卡托普利组，和营安心大、中、小剂量组，每组9只。以人与大鼠体表面积等效剂量比折算量为和营安心中剂量组，扩大两倍为大剂量组，缩小两倍为小剂量组，每次灌胃0.8 ml/100 g，1 次/d；卡托普利组配成0.45%蒸馏水溶液，每次灌服1 ml/100 g；正常对照组及模型对照组灌服蒸馏水1 ml/100g；参麦注射液组每天按5 ml/kg腹腔注射参麦注射液；连

9、续给药4周。1.3 观测指标1.4 统计分析实验数据用s表示，应用SPSS12.0进行统计学处理，用单因素方差分析进行组间比较。2 结果表1 和营安心方对血流动力学、心重指数的影响（略）与正常对照组比较，P0.05，P0.01；与模型对照组比较，*P0.05，*P0.012.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡结果正常对照组大鼠心肌未发现细胞凋亡，模型对照组大鼠心肌细胞凋亡严重，凋亡细胞呈孤立、散在分布，数明显增多，核内有分布均匀的棕褐色颗粒，体积等于或小于正常胞核，每2020视野平均3.9个；和营安心大剂量组、卡托普利组每高倍视野平均1.5个、1.8个，棕褐色细胞核数量较少；和营安心中剂量组、小

10、剂量组、参麦注射液组每高倍视野平均2.3，2.9，2.7个，棕褐色细胞核仍较多见。可见，各治疗组心肌细胞凋亡数明显低于模型对照组，和营安心大剂量组、卡托普利组改善慢性心衰大鼠心肌细胞凋亡的效果最好。表2 和营安心方对Bax，Bcl-2 ，Bcl-2/Bax的影响（略）与正常对照组比较，P0.05，P0.01；与模型对照组比较，*P0.05，*P0.01；n=83 讨论难经认为“损其心者，调其营卫”，内经在阐述“营卫致病”时提出了“营气衰少而卫气内伐”，和“营气稽留，血涩不行，卫气从之”的病机，我们据此提出了慢性心衰的中医病机假说为“营卫不和，营涩卫伐，淤结水停”，并拟定和营安心方，由西洋参、玉

11、竹、桂枝、云茯苓、丹参等组成。西洋参、玉竹益气生津，充养营气，益营和阴；桂枝、云茯苓、丹参疏卫通阳，活血化淤，宁心利水。全方补气生津，益营通卫，调和营卫，活血利水。现代药理研究表明，西洋参所含主要成分人参皂苷Rb1，玉竹所含主要成分铃兰苷、铃兰苦苷有良好的强心作用，而方中所含桂皮醛、丹参素、丹参酮等主要有效成分对慢性心衰也有良好调节作用4。本实验采取皮下注射ISO的方法复制慢性心衰大鼠模型，ISO连续12 d皮下注射总量达到80 mg/kg，儿茶酚胺大量入血、持续刺激造成心肌弥漫性急性坏死2，模型对照组大鼠LVSP，dp/dtmax明显降低，LVEDP，心重指数明显升高，表明左心舒缩功能明显受

12、损，并出现心室肥大，和营安心方大、中剂量组能明显升高LVSP，dp/dtmax，明显降低LVEDP、心重指数，对心功能、心室肥大有良好改善作用。细胞凋亡是遗传基因控制的细胞自主性死亡过程，是机体清除严重受损的细胞、不再需要的细胞和癌变细胞的自身防御性机制，包括Bcl2家族蛋白的调控和胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶的激活等机制。在Bcl2家族蛋白中，Bcl2，Mcl1以及Bclxl均对细胞的生存起着促进作用，即抑制细胞凋亡；而Bax，Bclxs，bak和bad则促进细胞的凋亡，即诱导细胞凋亡。Bcl2 protooncogene是一个抑制凋亡的原癌基因，Bax protooncogene是一个诱导细

13、胞凋亡的原癌基因，Bax与Bcl2结合，阻止Bcl2的激活，从而促进凋亡。Bax、Bcl2是调控心肌细胞的关键凋亡基因，两者的比例决定心肌细胞在受到凋亡刺激后是死亡还是存活。慢性心衰时存在广泛的心肌细胞凋亡，其中Bax基因表达显著升高，Bcl2基因表达及bcl2 /Bax比值明显下降，细胞凋亡使心肌细胞数量减少，导致心肌细胞肥大、纤维化增生，导致心室重构。而神经内分泌激素的持续异常激活是引起细胞凋亡的重要因素，细胞凋亡是引起心肌死亡乃至心肌重构的重要原因，也是心功能下降的主要原因5。而细胞凋亡的特征是核内DNA分解，产生DNA单链或双链缺口，TUNEL法即是在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，两种缺口3OH末端用地高辛-核苷酸标记，再用酶标记地高辛抗体予以显示，可以直接测定心肌细胞的凋亡。本实验研究表明模型对照组存在严重的心肌细胞凋亡，和营安心方能明显抑制慢性心衰时心肌细胞凋亡的发生、发展，改善血流动力学异常，减轻心重指数，进而减缓心肌重构的过程，提示和营安心方具有良好的调控慢性心衰心肌细胞凋亡的作用。【参考文献】1 沈 雁，曹洪欣，周景华. 温心胶囊对慢性心功能不全大鼠心功能和心肌基质金属蛋白酶组织抑制物1表达的研究J. 上海中医药杂志，2005，39（5）：55.2 李为民，田 颖，孔一慧，等. 异丙基肾上腺素致大鼠