代谢调节与代谢工程2

1、代谢调节与代谢工程1.直线式代谢途径中的反馈抑制直线式代谢途径中的反馈抑制：苏氨酸脱氨酶苏氨酸脱氨酶苏氨酸苏氨酸- -酮丁酸酮丁酸异亮氨酸异亮氨酸反馈抑制反馈抑制其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成其它实例：谷氨酸棒杆菌的精氨酸合成2.2.分支代谢途径中的反馈抑制：分支代谢途径中的反馈抑制：在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有：应，微生物发展出多种调节方式。主要有： 同功酶的调节，同功酶的调

2、节， 顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等。顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等。3.2.3 反馈抑制的类型反馈抑制的类型代谢调节与代谢工程(1)(1)同功酶调节同功酶调节isoenzyme定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的定义：催化相同的生化反应，而酶分子结构有差别的一组酶。一组酶。意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的意义：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。制作用。某一产物过量仅抑制相应

3、酶活，对某一产物过量仅抑制相应酶活，对其他产物没影响。其他产物没影响。举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节举例：大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节代谢调节与代谢工程代谢调节与代谢工程(2)(2)协同反馈抑制协同反馈抑制定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制定义：分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。举例：谷氨酸棒杆菌（举例：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）多粘芽孢杆菌（多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受

4、赖氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。代谢调节与代谢工程 天冬氨酸天冬氨酸 E,R 4-磷酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸E天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛E,R E二氢吡啶二羧酸二氢吡啶二羧酸 同型丝氨酸同型丝氨酸同型丝氨酸磷酸同型丝氨酸磷酸E,R R O-琥珀酰同型丝氨酸琥珀酰同型丝氨酸 苏氨酸苏氨酸 E,R六氢吡啶二羧酸六氢吡啶二羧酸 胱硫醚胱硫醚 2-酮丁酸酮丁酸 R 二氨基庚二酸二氨基庚二酸同型半胱氨酸同型半胱氨酸 R 赖氨酸赖氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸 异亮氨酸异亮氨酸天冬氨酸族天冬氨酸族（谷氨酸棒（谷氨酸棒杆菌）杆菌）代谢调节与代谢

5、工程代谢调节与代谢工程合作反馈抑制合作反馈抑制定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二定义：两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。者单独作用之和。举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受举例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和和GMP （和（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和和10%。代谢调节与代谢工程(3)积累反馈抑制积累反馈抑制定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑

6、制共同途定义：每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。用。代谢调节与代谢工程Try 16%Try 16%CTP 14%CTP 14%氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸 13%13%AMP 41%AMP 41%积累反馈抑制积累反馈抑制E.coliE.coli谷氨酰胺合成酶的调节谷氨酰胺合成酶的调节代谢调节与代谢工程(4) (4) 顺序反馈抑制顺序反馈抑制一种终产物的积累一种终产物的积累,导致前一

7、中间产物的积累，通过后者反馈导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。抑制合成途径关键酶的活性，使合成终止。举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节举例：枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节代谢调节与代谢工程 分支途径上游的某个酶受到另一条分支途径的终产物，甚至于本分支途径几乎不相关的代谢中间物的抑制或激活，使酶的活力受到调节，此即代谢互锁。 (5)代谢互锁代谢互锁3.2.4.2微生物代谢调节机制的多样性代谢调节与代谢工程代谢调节与代谢工程3.2.5避开微生物固有代谢调节，过量生产代谢产物避开微生物固有代谢调节，过量生产代谢产物工业发酵的目的：大量积累人们所需要的

8、微生物代谢产物。工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。谢朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段：人工控制代谢的手段： 改变微生物遗传特性改变微生物遗传特性(遗传学方法）；遗传学方法）； 控制发酵条件（生物化学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）； 改变细胞膜透性；改变细胞膜透性；代谢调节与代谢工程3.2.5.13.2.5.1工业发酵的目的工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。 在正常生理条件下在正

9、常生理条件下 微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物能量，也不积累中间代谢产物 代谢的人工控制代谢的人工控制 人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行着人们希望的方向进行 代谢调节与代谢工程 （1）对于直线式代谢途径：选育营养缺）对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物陷性突变株只能积累中间代谢产物 A a B b C c D

10、 d E 1)营养缺陷型菌株的应用营养缺陷型菌株的应用 末端产物末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物这样才能有利于菌株积累中间产物C 。遗传学方法遗传学方法代谢调节与代谢工程(2) 分支代谢途径：情况较复杂，可利分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中

11、间产物生产中间产物A B CDEFG代谢调节与代谢工程各图成立的条件：各图成立的条件：1. 1. 限量添加限量添加E E；2.2.限量添加限量添加E E；3.3.限量添加限量添加E E和和G G；4.4.限量添加限量添加E E和和G G；5.5.限量添加限量添加I I“”表示营养缺陷突变位置；表示营养缺陷突变位置；“”表示反馈调节解除表示反馈调节解除要根据其不同反馈控制机制 代谢调节与代谢工程谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产 E E：表示反馈抑制；：表示反馈抑制；R R：表示反馈阻遏：表示反馈阻遏 高丝氨酸脱氢酶（HSDH） 天冬氨酸激酶（AK) 赖氨酸生产

12、菌赖氨酸生产菌: : 高丝氨酸缺陷型 代谢调节与代谢工程分支途径分支途径赖氨酸发酵赖氨酸发酵( (谷氨酸棒杆菌的谷氨酸棒杆菌的代谢调控代谢调控) )代谢调节与代谢工程分支途径分支途径肌苷酸发酵肌苷酸发酵（IMPIMP合成途径的代谢调控）合成途径的代谢调控）调控理论的实践应用调控理论的实践应用代谢调节与代谢工程 P124表3-12用营养缺陷型菌株生产的各种氨基酸营养缺陷型菌株生产的各种氨基酸代谢调节与代谢工程2)2)抗反馈控制突变株的应用抗反馈控制突变株的应用抗反馈控制突变株抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏感或是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。对阻遏有抗性，或两者兼有之的

13、菌株。抗反馈控制突变株可以从抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性终产物结构类似物抗性突变株突变株和和营养缺陷性回复突变株营养缺陷性回复突变株中获得。中获得。获得方法及其原理：获得方法及其原理：代谢调节与代谢工程目标产物目标产物结构类似物结构类似物赖氨酸赖氨酸S-S-（2 2氨基乙基）氨基乙基）-L-L半胱半胱氨酸氨酸-(AEC)-(AEC)苏氨酸苏氨酸 - -氨基氨基- - - -羟基戊酸羟基戊酸（AHV)AHV)异亮氨酸异亮氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸精氨酸精氨酸D-D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸代谢调节与代谢工程营养缺陷型回复突变株营养缺陷型回复突变株 调节酶的变构

14、特性是由其结构基因决定的，如果调节调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。 如果前者发生回复突变，则又有两种可能性如果前者发生回复突变，则又有两种可能性另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。营

15、养缺陷型回复突变营养缺陷型回复突变 代谢调节与代谢工程 DA B C E F G2.生物化学方法生物化学方法u添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生(-)(-)(-)u发酵与分离过程耦合：发酵与分离过程耦合：u控制发酵的培养基成分：控制发酵的培养基成分：代谢调节与代谢工程3.2.5.2控制细胞膜渗透控制细胞膜渗透性性 使胞内的代谢产物迅速渗漏出去使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。解除末端产物的反馈抑制。 (1). 用生理学手段用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如如: 在在Gl

16、u发酵中把生物素浓度控制在发酵中把生物素浓度控制在亚适量亚适量可大量分泌可大量分泌Glu； 控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性； 当培养液中生物素含量较高时采用适量添加当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素青霉素的方法；的方法； 再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+； Mn2+的的作用与生物素相似。作用与生物素相似。(2). 利用膜缺损突变株利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型 如如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添用谷氨酸生

17、产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。产量。 甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。代谢调节与代谢工程控制细胞膜的通透性控制细胞膜的通透性生物素是脂肪酸生物合成中乙酰生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoACoA羧化酶的辅羧化酶的辅基，该酶催化

18、乙酰基，该酶催化乙酰CoACoA的羧化生成丙二酸单酰的羧化生成丙二酸单酰CoACoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸 只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。 甘油缺陷型菌株甘油缺陷型菌株 添加适量的青霉素添加适量的青霉素 油酸缺陷型菌株油酸缺陷型菌株 代谢调节与代谢工程谷氨酸发酵一、谷氨酸发酵菌种：Corynebacterium pekinenseCorynebacterium glutamicumBrevibacteri

19、um flavu二、发酵机理： 谷氨酸以-酮戊二酸为碳架；当以糖质为发酵原料时，合成途径包括EMP,HMP,TCA循环,乙醛酸循环等； 谷氨酸产生菌的-酮戊二酸脱氢酶活力很弱或缺少，而谷氨酸脱氢酶的活力要很高； 生物素是谷氨酸产生菌必需的一种维生素，在谷氨酸生物合成中起着重要作用，缺乏或量太高都会使谷氨酸合成受阻。生物素通过影响细胞膜的通透性而影响谷氨酸发酵。 代谢调节与代谢工程回补顺序谷氨谷氨酸酸+NH3谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 -酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶代谢调节与代谢工程1.谷氨酸生产菌中存在2个糖酵解途径EMP/HMP生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变

20、丙酮酸积累乳酸积累2.-酮戊二酸脱氢酶缺失TCA环阻断， -酮戊二酸积累代谢调节与代谢工程3.四碳二羧酸的来源在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶 谷氨酸对糖的转化率达到81.7% DCA循环标志酶：异柠檬酸裂解酶在谷氨酸发酵中，DCA环一方面可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充 在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量作用谷氨酸生成期中要封闭DCA环？通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%代谢调节与代谢工程4.异柠檬酸脱氢酶活力强提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系5.氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：-酮

21、戊二酸+NH4+NADPH+谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸 + 天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶谷氨酸-酮戊二酸+-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶代谢调节与代谢工程生产菌中谷氨酸转氨酶活力低，转氨作用可以不考虑谷氨酸合成酶由于不受高浓度谷氨酸抑制，其作用值得重视谷氨酸脱氢酶是合成积累谷氨酸的主要酶氨的导入时生物素缺乏， NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时， NH4+不影响糖代谢速度6.谷氨酸合成的调节机制谷aa比天冬aa优先合成谷aa脱氢酶谷aa对其反馈抑制和反馈阻遏柠檬酸合成酶TCA的关键酶，受能荷调节，谷aa反馈阻遏，乌

22、头酸反馈抑制异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸反馈抑制-酮戊二酸脱氢酶先天丧失或微弱PEP受天冬aa反馈抑制，受谷aa和天冬 aa反馈阻遏代谢调节与代谢工程7.细胞膜通透性控制代谢调节与代谢工程生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成代谢调节与代谢工程三磷酸腺苷三磷酸腺苷(ATP)(ATP)是为许多反应提供能量的高能磷酸化物是为许多反应提供能量的高能磷酸化物, ,细细胞中的胞中的ATPATP、ADPADP和和AMPAM

23、P含量处于相对平衡的状态含量处于相对平衡的状态细胞中的细胞中的能量状态能量状态3.2.5.33.2.5.3能荷（能荷（Energy chargeEnergy charge） 能荷（能荷（Energy chargeEnergy charge）来表示细胞中的能量状态。能荷（）来表示细胞中的能量状态。能荷（ECEC）可用下式来表示：）可用下式来表示： AMPADPATPADPATPEC2/ 系统中只有系统中只有ATPATP时，时，ECEC值为值为1 1；只有；只有AMPAMP时，时，ECEC值等于值等于0 0。 代谢调节与代谢工程能荷不仅能调节分解代谢形成ATP的酶活性，也能调节合成代谢利用ATP的

24、酶活性。 细胞能荷可调节酶活性高能荷抑制异柠檬酸脱氢酶和磷酸果糖激酶等柠檬酸和ATP都是磷酸果糖激酶活性的抑制剂，从而限制了葡萄糖的利用速度。 有氧条件下，大量合成ATP，细胞能荷增加异柠檬酸脱氢酶受到ATP抑制，导致柠檬酸的积累代谢调节与代谢工程在厌氧条件下，酵母菌无法通过呼在厌氧条件下，酵母菌无法通过呼吸链产生吸链产生ATPATP，细胞能荷较低。，细胞能荷较低。ADPADP和和AMPAMP激活磷酸果糖激酶，使利激活磷酸果糖激酶，使利用葡萄糖生产酒精的速度加快。用葡萄糖生产酒精的速度加快。 代谢调节与代谢工程第十二章 工业微生物发酵产品调节点主要在三个激酶，即己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激

25、酶。它们是糖酵解途径中的关键酶，是糖酵解途径的三个不可逆步骤糖代谢的调节主要是能荷的控制代谢调节与代谢工程3.2.5.4无机聚磷酸的代谢与无机聚磷酸的代谢与功能功能 磷酸盐和能量的储存。 重金属阳离子的解毒作用。代谢调节与代谢工程活性污泥中的聚磷菌 生活在营养丰富的环境中，在将进入对数生长期时，为大量分裂作准备，细胞能从废水中大量摄取溶解态的正磷酸盐，在细胞内合成多聚磷酸盐。细菌经过对数生长期而进入静止期时，若环境中的磷源仍有剩余，细胞又有一定的能量时，仍能从外界吸收磷元素，这种对磷的积累作用大大超过微生物正常生长所需的磷量，可达细胞重量的6-8，有报道甚至可达10。以多聚磷酸盐的形式积累于细胞内作为贮存物质。当细菌细胞处于极为不利的生活条件时，例如使好氧细菌处于厌氧条件下，即所谓细菌“压抑”状态时，聚磷菌能吸收污水中的乙酸、甲酸、丙酸及乙醇等极易生物降解的有机物质，贮存在体内作为营养源，同时将体内存贮的聚磷酸盐分解，释放到环境中来，以便获得能量，供细菌在不利环境中维持其生存所需，此时菌体内多聚磷酸盐就逐渐消失，而以可溶性单磷酸盐的形式排到体外环境中。代谢调节与代谢工程概念：有氧条件下，发酵作用受抑制的现象（或概念：有氧条件下，发酵作用受抑制的现象（或氧对发酵的抑制现象）氧对发酵的抑制现象）。意义：合理利用能源意义：合理利用能源通风对酵母代谢的影响通风对酵母代谢的影响通