血吸虫病检验复习资料

1、接红细胞凝集试验诊断血吸虫病浙江省血吸虫病防治中心 朱明东间接红细胞凝集试验（IHA），国外最早于1955年应用于检测马抗血清。国内陶义训等（1958）首先应用于诊断日本血吸虫病。杨赞元等（1976）应用冰冻干燥方法制备试剂，为现场使用创造了条件。一、基本原理 可溶性血吸虫虫卵抗原吸附于红细胞表面，使红细胞致敏。致敏红细胞与病人血清中特导性抗体相遇时，在适宜的条件下（电解质、温度、pH），红细胞表面吸附的抗原与特导性的抗体相结合，使红细胞被动地凝集起来，肉眼可见。间接红细胞凝集试验是抗原抗体反应的一种类型（红细胞为载体），属血清学反应中的凝集反应。凝集反应分为直接凝集和间接凝集反应。直接凝集反

2、应是细菌、细胞等颗粒性抗原与相应抗体反应。间接凝集反应是抗原吸附于载体上与相应抗体反应。间接凝集反应分正向、反向、抑制，正向是红细胞吸附抗原测抗体，反向是红细胞吸附抗体测抗原，抑制是在测抗体的样本中加入相应的抗原，凝集反应被抑制。作为载体应具有以下条件：1、在生理盐水或缓冲液中无自凝倾向。2、大小均匀，比重与介质相似，在一定时间内不下沉。3、无化学或血清学活性。4、能吸附抗原或抗体，而不影响抗原或抗体的特导性。二、冻干致敏红细胞的制备（一）血吸虫虫卵抗原制备人工感染家兔，每只家兔感染2000条左右日本血吸虫尾蚴，4345天后，解剖取出肝脏分离虫卵。将纯虫卵用丙酮脱水、脱酯干燥。取干燥虫卵1g研

3、磨成细粉，加入1/10000硫柳汞生理盐水100ml，使其成为1%的混悬液。将此混悬液放入冰箱内，每天冰融2次，连续5d，然后超声粉碎，高速离心（10000r/min）20min。经离心后的上清液，即为虫卵抗原原液，保存于-20中备用。理想抗原：敏感性高，特异性强，能区别不同感染度，能区别现在感染还是过去感染，价廉。但目前还没有理想的抗原。（二）红细胞醛化取人“O”型血红细胞3份（不同个体）混合，加入等量的改良阿氏ACD保存液，置于4内，13d后，用生理盐水洗涤3次，移入刻度离心管内，用3000r/min，离心5min，记录压积红细胞数量。按沉积红细胞及1ml pH7.2PBS 25ml的比例

4、，配成红细胞悬液。容器置冰浴内，将戌二醛溶液慢慢滴入红细胞悬液中，边加边摇，醛化1h。然后用pH7.2PBS洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，用1/10000的柳硫汞蒸馏水配成10%的红细胞悬液，置于4备用。注意事项：1、红细胞要清洗干净，除去表面粘附的血桨蛋白。2、戌二醛的浓度逐渐提高，防止血球变形。3、保持低温状态。4、不断摇动，使戌二醛与红细胞充分接触。醛化红细胞优点：1、克服了个体差异，保证实验重复性。2、延长红细胞的保存时间，在4可保存1年。3、避免操作过程中因振荡、低渗、冻融使红细胞破裂、溶血。（三）红细胞鞣化取1%的鞣酸溶液1ml加入100mlpH7.2PBS中配成1/10000浓度。将

5、醛化红细胞用pH7.2PBS洗涤1次，并配成2.5%红细胞悬液，然后加入等量的鞣酸溶液，置于37 中15min，并不断摇动。再用pH7.2PBS洗涤3次，去除多余的鞣酸。最后用pH6.4PBS配成2.5%红细胞悬液。注意事项：1、时间与温度，鞣酸溶液预热至37与2.5%红细胞悬液混匀后，开始计时。2、鞣酸溶液浓度，过高易自凝，过低敏感性下降。鞣化红细胞的优点：鞣化后红细胞易吸附蛋白抗原。（四）红细胞致敏 取虫卵抗原原液用pH6.4PBS作1:100稀释，与2.5%的鞣化红细胞等量混合，置于37水浴中30min，并不断摇动，然后离心洗涤3次，去除多余抗原。再用含有1%正常兔血清（56灭活）pH7

6、.2PBS洗涤1次，并用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56灭活）的pH7.2PBS保护液，配成10%浓度的致敏红细胞悬液。致敏效果与抗原的活性及纯度有关。（五）致敏红细胞的冰冻干燥将上述致敏红细胞悬液摇匀，分装于2ml安瓿内。每支0.4ml，立即放入-40冰箱冰冻，待全部分装完毕后，移入冰冻干燥机内，冰冻干燥约24h，干燥后封口，保存于4中备用。冰冻干燥具有高科技含量不是单纯干燥，在冰冻状态下使水分子升华，不使红细胞破裂，不影响抗原活性。三、操作步骤（一）取生理盐水2ml，加入装有冰冻干燥红细胞的安瓿中，配成2.5%的红细胞悬液，摇匀。（二）在“V”型微量血凝反应板的第1孔中加生理盐水100l

7、, 第2、3孔中各加25l。（三）第1孔中加待检血清25l，混匀后吸出25l加于第2孔中，在第2孔中混匀后，吸出25l加于第3孔中，混匀后弃去25l。此时第1、2、3孔中的血清稀释度依次为1:5 、1:10 、1:20。（四）在第2、第3孔中各加致敏红细胞悬液25l，将反应板放在振荡器上振荡1min，室温下静置45min，观察反应结果。四、反应标准（一）阴性反应：红细胞全部下沉在凹底部，形成紧密的圆点，周围整齐清晰。（二）阳性反应：待检者血清以1:10稀释度出现凝集反应为阳性起点。（三）反应强度：“+”多数红细胞下沉在底部形成圆点，周围可见少量凝集红细胞；“+”凹底部可见明显的红点，凝集红细胞

8、在底部形成小薄层；“+”凹底部可见很弱的红点，红细胞呈疏松的颗粒凝集；“+”红细胞呈明显的颗粒凝集，均匀散布于凹底部周围形成薄层，有时呈皱褶状。效价（滴度）：发生凝集现象最高的血清稀释度，称为该血清抗体的效价，也称滴度。五、影响因素及注意事项（一）试剂：应保存在4C，有效期12个月。每次试验应作阳性血清、阴性血清及生理盐水对照。阳性血清效价达到1：640以上，试剂方可使用。使用时红细胞悬液应充分摇匀。 （二）反应板：应选择“V”型，底角应为900。“U”型及不同底角的“V”型反应板将影响检测结果。反应板使用后，用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2次，晾干即可，切勿用化学洗涤剂清洗。（三）毛细

9、吸管：所用毛细吸管应校正至每滴等于25l（即1m1为40滴）。使用毛细吸管时应保持与反应板垂直。（四）血清样本：待检血清样本以新鲜为宜，不能及时检测的血清应保存在冰盒内。溶血样本将影响测定结果的准确性。（五）生理盐水：用于稀释IHA试剂、阳参、阴参、血清样本的生理盐水必须保持无菌。（六）判断反应结果：在判断反应结果时应在反应板下面衬一张白纸，使反应结果更加清晰。先观察空白对照、阴参、阳参，再观察样本。六、评价IHA的优点：敏感性高，操作方便，血量少，便于现场使用；试剂生产方便，成本低，符合国情。IHA的缺点：特异性欠强、与其它吸虫有较高的交叉反应。IHA的特导性、敏感性及交叉反应检测结果见附表

10、。附表 IHA的特导性、敏感性及交叉反应试剂编号 正常人血清 慢血血清 肺吸虫血清 肝吸虫血清 阴性率（%） 阳性率（%） 阳性率（%） 阳性率（%） 1 100 92 55 0 2 97 94 75 10 3 100 90 40 5 4 97 92 60 0 5 97 96 65 10 6 94 94 60 10 7 100 90 七、实用价值（一）可作为血吸虫病的辅助诊断。无血治史者和治疗史3年以上者，IHA阳性可给予扩大治疗。（二）在血吸虫病流行区，可作为查病的过筛方法。（三）可作为血清流行病学调查及疫情监测的方法。4斑点金免疫渗滤试验诊断血吸虫病浙江省血吸虫病防治中心 朱明东免疫金标记

11、技术是继免疫荧光、免疫酶、放射免疫三大标记技术之后发展起来的新技术。斑点金免疫渗滤试验（Dot immunogold filtration assay, DIGFA）用硝酸纤维素膜（NC）为固相载体，以亲和层析原理为基础，采用胶体金标记的抗体或抗原追踪相应的抗原或抗体，具有特异性强、敏感性高、方法简便、快速、无需特殊仪器等诸多优点。现将斑点金免疫渗滤法及其在血吸虫病诊断中的应用介绍如下。一、基本概念（一）溶胶的概念1、溶胶：一种物质以微小的粒子分散于另一种物质中，构成一个分散体系，这种分散体系即称溶胶，其中被分散的物质叫分散相，容纳分散相的物质称分散介质，根据分散相粒子直径大小不同，可以把分散

12、相分成三类：粒子直径大于100nm者称粗分散体系；粒子直径在1-100nm之间者称胶体分散体系；粒子直径小于1nm叫分子、离子分散体系，即一般溶液。2、溶胶制备：分散法：将粗分散体系中的大粒子进一步提高其分散度，使构成一定大小颗粒的胶体分散体系。凝聚法：与分散法反之，把溶液中的溶质分子凝集成多分子的聚集体，构成一定大小粒子的胶体分散体系。3、影响胶体稳定的因素：温度增高，强光照射，电解质等因素均可影响溶胶的稳定性。溶胶属于超微不均匀体系，具有热力学的不稳定性，放置一段时间后分散相粒子的大小会发生改变，胶体颗粒会自动合并成粗颗粒，最后沉淀析出，这一过程称为聚沉。（二）胶体金的概念1、胶体金：氯金

13、酸在还原剂的作用下，可聚集成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液，由于静电作用而成胶体状，故称胶体金。它具有溶胶的特性，其中分散相的粒子直径在1-100nm之间。2、胶体金的特性：未标记的胶体金对热不稳定，不用时应置4冰箱，保存期一周，久置液面会出现一层金膜；胶体金对酸碱比较敏感，pH调节不当会产生聚集现象。二、胶体金的制备（一）制备胶体金的注意事项1、玻璃器皿的净化处理：玻璃器皿的清洁程度对于还原过程有较大的影响，少量污染会干扰胶体形成，以致颗粒大小不均或呈混浊状态。因此用于制备胶体的玻璃用器必须非常清洁，并专门化。净化过程除了用酸浸泡、蒸馏水冲洗外，也可将用器硅烷化，或者直接用第一次

14、生成的胶体稳定用器的表面，弃去后再用双蒸馏水冲洗后使用。 2、试剂配制要求：所有溶液都必须用双蒸水配制。氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）是种极易潮解的结晶形化合物，所以在配制时，应将整瓶氯金酸一次性溶解成1%水溶液，该溶液在密封条件下4能保存数月之久。氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘；碳酸钾溶液每隔4周重新配制；柠檬酸钠溶液在临用前配制。（二）配制方法制备胶体金的方法很多，最常用的为化学还原法。化学还原法的基本原理是氯金酸在还原剂的作用下，使金离子还原成金原子。用于制备胶体金的还原剂有50余种，其中在生物医学领域中常用的还原剂有柠檬酸、鞣

15、酸和硼氢化钠。现就柠檬酸还原法介绍于下：柠檬酸还原法：该法制备胶体金的过程比较简单，所制金颗粒大小较均匀，因此广为应用。方法是取0.01%HAuCl4水溶液100ml加热煮沸，在剧烈搅拌下迅速加入1%柠檬酸钠水溶液。此时溶液很快变蓝色（5min），继续加热至溶液由蓝转成亮红色为止。通过改变柠檬酸钠容量，可以制备颗粒直径大小不同的胶体金溶液，一般金颗粒的大小是柠檬酸钠用量的函数。根据加入柠檬酸钠量的不同，可合成3-20nm颗粒大小的胶体金，而且比较稳定，在4可保存一年。三、胶体金标记物的制备（一）胶体金标记技术的基本原理免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)

16、是一种新的免疫标记技术，它的示踪标记物是胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的吸附过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，可以与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，由于结合是物理过程，故很少引起蛋白质活性的改变，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。金颗粒有高电子密度的特性，这些被标记的颗粒能在相应的配体处大量聚集，形成肉眼可见的红色或淡红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。 （二）胶体金与蛋白质结合的条件1蛋白质等大分子的标前处理： 待标记蛋白

17、质一般经过盐析、离子交换、凝胶过滤和亲和层析获得。应选择纯度好，效价高，特异性强的蛋白质作为标记。由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，标记前尽量去除盐分，以防胶体金聚沉和干扰胶体金与蛋白质的结合。须注意蛋白质溶液应绝对澄清、无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。2胶体金pH值的调整：蛋白质对金颗粒具有pH依赖性，一定蛋白质在它的等电点或稍偏碱时与胶体金结合率最高，而且比较稳定，因此在标记前必须根据蛋白质的等电点调节胶体金的pH值。3最适蛋白稳定量的测定：待标记蛋白质的量对胶体金的稳定状态起着决定作用。所以胶体金与标记蛋白质用量比例十分重要。标记时应采用最小蛋白用量来达到与胶体金的充

18、分结合。这样不仅可以节省蛋白质的用量，而且可以简化纯化的步骤，方法见表2表2 胶体金与标记蛋白质用量比例的测定试管12345胶体金（ml）111111mg/ml蛋白质（µl）246810% NaCl（ml）0.10.10.10.10.1结果观察蓝微蓝浅红红色红色注：胶体金与蛋白质混匀后5min再加10% NaCl。一般选用蛋白质的量是达到或超过最低稳定量的管，即红色保持不变，表中的第4管即为稳定1ml胶体金最适宜蛋白用量，然后在此基础上再加10%，即为标记蛋白质的实际用量。（三）胶体金与蛋白质结合根据上述方法确定胶体金与蛋白质的最适比例后，根据实验需要计算标记蛋白的实际用量。例如：表

19、2第4管中，1ml胶体金需要6ug蛋白质的最适比例，在此基础上增加10%，即为6.66µg/ml。具体步骤如下：取100ml胶体金置净化的玻璃烧杯中，在磁力搅拌下缓缓地加入666µg蛋白质，然后加适量小牛血清白蛋白，再高速离心，用毛细管轻轻吸去上清液（一般为游离蛋白和未稳定的胶体金），沉淀用缓冲液悬浮至原容量的10%，此结合物在4可保存半年以上。四、斑点金免疫渗滤法（DIGFA）在血吸虫病诊断中的应用斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验，又名滴金免疫测定

20、法（简称滴金法）。DIGFA与目前所应用的放射免疫标记、荧光免疫标记、酶标记等相比，操作简单、省时、无毒无致癌性物质，又无需昂贵仪器，同时具有高度的特异性和敏感性，还具有易制备、能保持标记物的生物活性等优点，在临床检验中应用日渐广泛。（一）DIGFA原理DIGFA是采用硝酸纤维素膜（NC）为固相载体，以亲和层析原理为基础，免疫胶体金结合物同时作为探针和指示剂而建立起来的一种简易、快速、灵敏的免疫新技术。将可溶性抗原以物理吸附或结合在某些固相支持物（或载体）表面（如微孔滤膜），并保持其原来的免疫学活性，再与相应抗体通过渗滤相结合形成抗原-抗体结合物。然后再加入金标记抗体，使与抗原-抗体复合物结合

21、，通过金颗粒来放大免疫反应系统，反应结果在固相载体NC膜上显示红色斑点，颜色深浅与待测的相应抗体量成正比。利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在这一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。（二）DIGFA主要特点1、快速、灵敏。DIGFA技术中，由于固相载体采用了多孔结构的NC膜，使得其反应表面积与容纳样品溶液的空间比值较大，样品溶液中抗原或抗体能有充分机会接触点样膜上的抗体或抗原，从而加速抗原、抗体反应的速度，缩短反应时间；此外，DIGFA技术采用了亲和层析原理，样品溶液以一定速度流过NC膜时，抗原或抗体发生特异性结合，样品中的抗原或抗体滞留在NC膜上，而其它成份随样本溶液和洗

22、涤液流出NC膜。随着样本溶液不断流经NC膜，待检抗原或抗体在NC膜上的含量不断提高。有人采用125I标记的hCG作为标本，研究试验的反应动力学，结果证实，滴金免疫试验中抗原、抗体反应速度的常数与液相中的反应速度基本接近。而固相ELISA技术中，由于抗原、抗体反应是在固相表面进行，样品溶液在静止状态中，仅靠自然扩散与载体上包被的蛋白进行反应，所以抗原和抗体结合反应达到平衡所需的时间长，在37时，需要1-2小时。ELISA需经数小时反应才能达到平衡的抗原、抗体反应，在滴金免疫测定法中不到几分钟就能完成。2、简易、方便。在DIGFA技术中，由于待测样本溶液通过微孔膜渗滤，犹如通过层析柱一样，少量洗涤

23、液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤的目的，因而操作十分简易。此外，由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性，被标记的颗粒能在相应的配体处大量聚集形成肉眼可见的红色斑点，所以结果容易判断，阳性结果显示红色斑点，阴性则仅留白色背景，而且不需要任何特殊仪器，结果还可以长期保存，利于回顾性分析和研究。（三）试剂盒的组成1、抗原固相膜：将抗原或抗体点样于NC膜，自然干燥后，置塑料袋密封保存于4冰箱；2、测定装置：系一个特制的4×3×0.6cm塑料小盒，分盒底、盒盖二部分，盒盖中央有一个0.6cm小圆孔，盒内充满吸水垫料、紧贴盒盖小圆孔放一张抗原或抗体点样膜，紧闭盒盖即成测定装置；3、试剂A

24、与B：A为金标记结合物，B为PH 8.2的0.02M Tris-HCl缓冲液。（四）金标抗人IgG探针制备胶体金溶液按柠檬酸钠还原法制备，即0.01%氯金酸水溶液100ml加热沸腾，加入适量柠檬酸钠，继续加热，煮沸至溶液呈亮红色为止。冷却后调pH至9.0，按一定比例加抗人IgG，将两者混合，加适量牛血清白蛋白，然后高速离心纯化。（五）测定顺序1、将反应板平放于实验台面上，在塑料小盒中央孔内加B液2滴（100µl）待渗入；2、加待检血清25µl待渗入；3、加B液2滴（100µl）待渗入；4、加A液2滴（100µl）待渗入；5、加B液2滴（100µ

25、l）待渗入，洗去未结合的胶体金标记物；6、肉眼观察结果：在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判为阳性反应，反之则为阴性。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。DIGFA测定顺序如图1示12 3 4 5图1 B液 样品 B液 A液 B液（六）注意事项1、每批试剂均设质控小盒，以控制试剂的质量。操作方法同上，但不加血清。质控点以人IgG点膜，检测结果为阳性。2、每批试验均要设阳性和阴性对照。3、试剂应置4保存，有效期6个月。（七）现场应用根据沈丽英等报道，采用该方法检测各类血清4632份，结果显示：检测急、慢性血吸虫病抗体的敏感性分别达100%和96.8%；对非流行区正常人群血清的阴性符合率为100

26、%；检测疫区居民808人，Kato粪检阳性81人，其中抗体阳性79人，阳性符合率达97.5%，并同时检查肺吸虫病血清45份，华枝睾吸虫病血清15份，除肺吸虫病有3.3-6.7%的交叉反应外，其余均为阴性。为进一步探讨DIGFA检测抗体在血吸虫病传播阻断地区的应用价值，在已建立DIGFA的基础上，检测原血吸虫病重度流行区、中度流行区和低度流行区人群共2097人份，其中阳性检出率分别为6.18%，3.31%和1.47%，三者间有非常显著性差异；对现血吸虫病中度流行区人群的阳性检出率为39.33%，与传播阻断地区的检出率也有非常显著性差异。因此DIGFA检测血吸虫抗体的敏感性高，特异性强，适用于流行

27、病学调查、临床检测，也可作为考核血吸虫病防治效果的一种方法。血吸虫病病原学检查浙江省血吸虫病防治中心 朱明东血吸虫病的诊断，一般可分为临床诊断和实验诊断。临床诊断是根据病史、症状和体征作出初步诊断，但不能确诊病人。实验诊断包括病原学诊断和免疫学诊断。血吸虫病的病原学诊断有粪便检查和活组织检查两种，若在受检者的粪便或活组织中查见虫卵或毛蚴，即可诊断为血吸虫病人。血吸虫病的粪便检查有镜检法检查虫卵，孵化法检查毛蚴，也有孵化结合沉渣镜检。由于孵化法取用的粪便量多，在粪内只要有少数活虫卵就能查见，检出率比较高。孵化后的沉渣镜检，能检出部分孵化检漏的病人，可进一步提高检出率，孵化结合镜检是我省目前血吸虫

28、病病原学检查的主要方法。本文介绍粪便尼龙绢袋集卵孵化结合沉渣镜检及和改良加藤涂片法（kato-katz法）。一、病原学诊断的理论基础为何能在粪便中查到寄生在血管里的血吸虫的虫卵?先从血吸虫产卵及虫卵分布讲起。雌雄合抱的成虫寄生在人或哺乳动物的肠系膜静脉内产卵，雌虫在寄生期间的排卵能力可有变化。如小鼠感染日本血吸虫（大陆株）后2633d，每条雌虫日平均产卵150个，34d为664个，44d为时达2 092个，58d为929个，68d为370个卵。雌虫产出的虫卵大部分沉积在肠和肝等组织，仅小部分可随粪便排出体外。如小鼠感染大陆株日本血吸虫44d产卵最多时（2 092个/日），分布于大肠、肝、小肠、

29、自粪便排出和其它组织虫卵的比例分别为50.5%、22.5%、18.3%、7.7%及1%。又如用山梨株日本血吸虫尾蚴感染ddy小鼠415wk观察，平均每条雌虫每天产卵2 100个。到15wk时，从粪便排出的累计虫卵数占总产卵的28.2%；组织内虫卵以小肠为主，占沉积虫卵数83.2%，而肝内为15.5%。表明，同一种血吸虫的不同地域株和不同宿主，雌虫产出的虫卵在组织内的分布及排出体外的数量不尽相同。刚从雌虫产出的虫卵为单细胞卵，含1个受精卵和20个（1630个）卵黄细胞，在组织内经1011d发育成熟（含毛蚴卵），成熟卵在组织内成活时间约为11d。因此，日本血吸虫卵自产出、发育成熟到死亡约经2122

30、d。血吸虫卵从血管中通过肠壁（日本、曼氏血吸虫）或膀胱（埃及血吸虫）等组织释放到肠腔或膀胱腔中，然后随粪便或尿液排出，我们即可取粪便或尿液作病原学检查。但其机理尚未很好了解，一般认为涉及很多因素：虫卵的刺、血流的压力、肠蠕动以及毛蚴分泌的蛋白质酶等。其实，首要的应是随着虫卵中毛蚴的发育成熟，在虫卵周围形成病变，这是必要条件。所以排至外界的虫卵大多是含活动毛蚴的成熟卵。成熟卵在合适的条件下可脱壳而出。因此，从粪便内检查毛蚴，即毛蚴孵化法为日本血吸虫特有的诊断技术。二、尼龙绢袋集卵孵化法曾采用的孵化法有量杯烧瓶沉淀孵化法、塑料杯顶管孵化法、尼龙绢袋集卵孵化法等。尼龙绢袋集卵孵化法有下列优点：（1）

31、毛蚴计数高；（2）用水量少，可减少劳动力；（3）由于不需换水，可缩短操作时间，23min即可入瓶孵化；（4）器材轻巧，携带方便。为此，我们确定采用尼龙绢袋集卵孵化法。（一）毛蚴孵化的条件成熟的血吸虫卵有机会落入自然界水体中，条件适合时，卵内毛蚴活动增强，在卵内不停地转动，最终破壳而出，在水体中游动，这一过程称孵化。毛蚴从卵内逸出的时间非常迅速，仅0.10.3s。日本血吸虫卵孵化时卵壳大多数呈纵裂，毛蚴迅速从纵向裂口逸出。1、渗透压一般认为介质的低渗透压作用是血吸虫卵孵化的主要因素。成熟血吸虫卵在血液、肠内容物或尿液中是不能孵化的，仅被淡水稀释之后才能孵出毛蚴。粪便中的日本血吸虫卵需待粪液被稀释

32、至一定混浊度以下始能孵化。研究证明，在0.70.9%氯化钠溶液中，大多数日本血吸虫卵的孵化被抑制，1.2%及其以上浓度全部虫卵不能孵化。0.8%氯化钠溶液的渗透压相当于4.0大气压（表1）。表1 日本血吸虫卵在氯化钠溶液中一天的孵化力（温度20）氯化钠溶液浓度（%）未孵化虫卵数孵 化虫卵数孵化率（%）渗透压（大气压）1.084 3 3.44.10.887 1 1.13.30.676 2020.82.50.434 4557.01.70.230 4660.50.8对照1911685.9若以清水中的虫卵孵化率为100%，而在0.2%氯化钠溶液中虫卵的孵化率不减，在0.5%溶液中孵化率降为60%，在0

33、.8%中降至7.5%，在1.0%中降至1.8%，未孵出毛蚴的虫卵在当时看来还是活的。2、温度温度是促使毛蚴孵化的必要条件。虽然毛蚴可在237范围内孵化，但以1030的孵化居多，而最适温度为25左右。低于10或高于37，大多数虫卵的孵化受抑制。一般是温度愈高，孵化愈快，毛蚴寿命也愈短（表2）表2 不同月份平均温度下日本血吸虫毛蚴孵化起讫时间月份气温（）水温（）开始孵化时间（h）毛蚴最多时间（h）毛蚴消失时间（h） 1 3.0 59445570 92 2 5.0 814375170103 310.0 625194056 65 412.0 917192534113 521.02124 31126 3

34、1 625.62426 158 44 729.02630 2611 26 828.32729 2411 17 929.72528 1411 201015.71620 31721 411113.51516 41016 271210.0 914447381109（江苏血防所，1956）根据室内家兔肝卵实验证明，秋季（9月中旬到11月上旬）是粪检查病最好季节，其次是春季（3月上旬到6月下旬），最差是冬季（11月中旬到下年2月下旬）（表3）。出现这种情况，可能是由于在同样的感染期内，成熟虫卵的比例在冬季要明显低于其它季节。表3 各季节毛蚴孵化试验孵出毛蚴的理论值月份自然条件毛蚴孵化组定温全光照毛蚴孵化

35、试验组上旬中旬上旬中旬 3 89.1134.6 34.0101.7 4 95.3 75.4104.1 14.0 5110.2168.2114.8145.2 6 43.3114.5 71.0160.5 7 86.1 79.7123.1155.2 8 58.0 28.2147.1101.4 9 62.0147.0118.1169.810140.4199.1164.2188.811201.9 46.5171.2 44.112 19.1 31.2 25.1 41.9 1 71.4 7.9 82.7 55.6 2 17.4 6.0 43.8 98.83、光线光线对毛蚴孵化的影响说法不一，看来光线对孵化不

36、起决定作用。黄天威（1952）观察，在完全黑暗的环境中，虫卵几乎不能孵化。光线能加速虫卵的孵化，光线愈强虫卵孵化愈速，但在75w至300w人工灯光或强阳光下，虫卵孵化速率相似，大多虫卵在56h孵出。作者在实验中观察到大部分虫卵在全黑环境可孵化，但速度较慢，部分虫卵孵化被抑制，表明光线是促使孵出毛蚴的动力。4、水质及pH在试验的4种水样中，以（1）井水（pH7.47.6）对日本血吸虫卵的孵化效果最好；（2）搁置24h自来水（ph7.47.6，余氯00.25ppm）次之；（3）煮沸冷至室温的自来水（pH8.8，余氯0）第三；（4）新鲜自来水（pH7.38.6，余氯0.41.06ppm）最差。认为自

37、来水中余氯含量高是影响毛蚴孵化的主要原因，水中余氯含量大于0.3ppm即可影响毛蚴孵化。水中含氨不是影响毛蚴孵化的原因，即使氨含量到达1.5ppm亦未见对毛蚴孵化产生影响，上述4种水含氨量均低于1.5ppm。不能用蒸馏水、矿泉水和煮沸后冷却自来水作毛蚴孵化。毛蚴在蒸馏水中能够孵化，但孵出后毛蚴的活动依赖于介质中钠离子的存在，水中如不加入钠离子（阈值约0.5mmol/L），毛蚴的活动时间最多只有510min，活动的毛蚴少于15%，而在钠离子的溶液中毛蚴活动率达80%。煮沸后冷却自来水的pH值升高为8.8，亦能影响毛蚴的孵化。矿泉水可能因矿物质多而使水的渗透压高，从而影响毛蚴的孵化。虽然日本血吸虫

38、卵在pH3.08.6范围内可以孵化，但最适宜于孵化的pH为7.47.8范围。酸性愈高愈不利于孵化，pH2.8已完全抑制虫卵的孵化。另一方面，碱性愈高也有害于虫卵孵化，在pH10以上时，虫卵孵化已完全被抑制。5、其它实验证明，曼氏血吸虫卵孵化不受有氧或无氧状态的影响。硫代硫酸钠对血吸虫卵的孵化无不良影响，故在自来水中加入1×10-4mol硫代硫酸钠可去除余氯。在混浊的井、河水中，加入1/30001/9000浓度的明矾可使浊水澄清，实验证明1/3000浓度以下的明矾不影响毛蚴孵出，1/10001/2000浓度可抑制毛蚴孵出，但不影响虫卵的活力，而1/500浓度则有杀死卵的作用。（二）毛蚴

39、的行为1、游动毛蚴体表具有21（或22）个扁平的纤毛上皮细胞，每个纤毛上皮细胞生长有无数根纤毛，每根纤毛长45m。它们的煽动能使毛蚴在水中很快地游动并旋转前进，其游速平均为2.19±0.20mm/s，而每秒游动方向改变率的中位数值为54°。毛蚴的游速与其时龄、温度、光照度有关。刚孵出的毛蚴游速为2.27mm/s，15h为2.00mm/s，8h后下降为1.52mm/s。在温度为4、12、22及34时，毛蚴的游速分别为0.5、1.4、2.2及3.8mm/s。光照强度与毛蚴游速呈直线相关，回归方程：Y=0.009X+1.510，式中：Y为毛蚴游速，X为光照度。毛蚴的活力和寿命与水

40、质、水的温度及pH等因素有密切关系。在2025时，日本血吸虫毛蚴一般可活10h以上。pH7.58.5时毛蚴活动良好，在pH78时毛蚴一般可活56h，pH6或10时可成活23h，pH45时仅成活12min。盐浓度高于或相当于0.7%时，毛蚴成活时间逐渐减少。盐浓度为0.157%和0.35%时，毛蚴成活时间明显地较淡水中为长。2、趋性血吸虫毛蚴对其周围的物理因素往往能产生应答反应，许多研究者曾观察了毛蚴的反应行为。一般说来，毛蚴的趋性可表现为向光性、向温性、背地性（向上性）。日本血吸虫毛蚴多趋向弱光（36003800Lux），回避强光和黑暗。在15时任何光照度均具有正趋光性，在20时对2000Lu

41、x以下的光照呈正向光，在25为500Lux以下， 30为50Lux以下为正向光，表明毛蚴的向光性与温度有关。日本血吸虫毛蚴的趋温性反应不如趋光性明显，在1434温度范围中选择14的区域，在720的温度范围中，毛蚴选择1315的区域。毛蚴在水层中具有向上性（背地性），不论在黑暗或光亮的环境中毛蚴均有这一趋性，而且向上性较向光性为强。如在水柱的底部照光，而上部使其黑暗，大多毛蚴仍然集中在水柱的上层。由于毛蚴具有向上性，所以我们观察毛蚴的位置应是三角烧瓶的颈部。（三）器材1、验收登记材料： 粪检花名册、标签。2、集卵器材（1）尼龙绢袋：选260目/25.4mm尼龙绢袋，其孔径为4961m，使用中经热

42、水反复浸泡后缩小至4453m，而血吸虫卵大小为74106（平均89）×5580（平均67）m，故绝大多数虫卵不会在冲洗过程中漏出袋外。袋的上口直径810cm，长20cm，下口直径1.5cm。（2）三角烧瓶：500ml或250ml。（3）铜丝筛（50目/25.4mm）、压舌木板（或竹快）、塑料夹、塑料漏斗。3、淋水冲洗器材：冲洗操作台、铝茶壶、粪桶。4、观察毛蚴器材：日光灯、黑板或黑卡纸、吸管、载玻片。5、镜检器材：显微镜、试管架、10ml试管、载玻片。6、清洗灭卵器材：铝锅、煤球炉（或电炉）、大塑料盆、瓶刷、肥皂、洗衣粉、毛巾等。（四）操作技术1、验收登记验看粪便的质量、数量及标签。

43、核对送检名单无误后，重写省粪检标签3张，统一编号，然后在省粪检花名册上登记，弃去原标签，将重写的3张标签插入包粪纸中。2、淋水冲洗取3只三角烧瓶，在其颈部各套上一根橡皮筋，取粪包中的3张标签，各折成宽约1cm的长条，夹在三角烧瓶颈部的橡皮筋中。取漏斗、压舌木板、铜丝筛各一个，取尼龙绢袋1只，下口用塑料夹夹住。将重约90g的大便分为3等份，先取1份大便置于4060目/25.4mm铜筛中淋水调浆，通过漏斗使粪液滤入260目/25.4mm的尼龙绢袋中，然后移去铜筛及漏斗，将漏斗水洗后套在三角烧瓶上。继续淋水冲洗袋内粪渣，用压舌木版轻轻振荡尼龙绢袋，使加速过滤，直至滤出液变清为止。弃去尼龙绢袋下部的塑

44、料夹，将袋内的滤渣通过漏斗淋洗入三角烧瓶，加水满至瓶颈，放入孵化箱（室）或在室温下孵化。另2份大便再按上法分别淋水、调浆、冲洗，尼龙绢袋、铜丝筛、漏斗、压舌木板及塑料夹等因同一人粪不必要更换，但不同人粪均应更换，防止污染。3、观察毛蚴一般需观察2、3次，观察时间随温度高低而不同。温度高时毛蚴孵化快，温度低时毛蚴孵化慢（表4）。表4 不同温度下观察毛蚴的时间温度（）孵化后观察毛蚴的时间（h）第1次第2次第3次300.5-1.0 4 82630 4 8122025 81224201224附：在水温为2226下，观察牛粪的毛蚴时间为进孵后1h、3h、5h各1次，猪粪为进孵后5h、8h、12h各观察1

45、次。观察毛蚴时，应将烧瓶向着光源，并衬以黑纸板。要注意毛蚴与水中原生动物的区别（表5）。如见可疑虫子，要用吸管吸出，在显微镜下鉴定。表5 血吸虫毛蚴与水中原生动物的区别要点鉴别要点血 吸 虫 毛 蚴水 中 原 生 动 物形 状针尖大，大小一致，稍带长形大小不一，扁形或圆形颜 色透明发亮，有折光灰黄或灰白色，不透明，无折光游动速度游动迅速，来回不停，匀速前进游动缓慢，时游时停，游速不匀游动方向都为直线的斜向、横向、直向前进多为曲线，无一定方向游动方式碰壁后折回，一般不在中途改变方向，折回后又直线匀速前进呈间歇式、波浪式、螺旋式、跳板式和摇摆式等游动范围多在水面下14cm处范围广，水之上、中、下层

46、都有（五）注意事项1、粪便必须新鲜血吸虫卵存活情况受温度影响十分明显。虫卵在0时存活时间最长，直到81d才全部死亡，在0以上时温度愈高，死亡愈快，在0以下时温度愈低，死亡也愈快（表6）。表6 日本血吸虫卵在外界存活时间与温度关系温 度 （）-20-10033845505560虫卵100%死亡时间30s4h81d37d17d8h1h3min1s（Ito，1955）送检的大便冬季不宜超过24h，夏季不超过12h。粪便量要足，每包粪便重90g，不足者要再送。2、包粪纸张要洁净切勿用包过农药、化肥或其它化学品的纸张。3、孵化用水：要除去余氯和水虫。（1）城市用自来水作孵化时，含氯量过高，要放在缸内过夜

47、，让其自然脱氯，或在水中加入少量硫代硫酸钠（每50kg水中加入硫代硫酸钠溶液0.20.4g）除去余氯，0.5h后使用。（2）用河水或井水时，可将水加热至60或过滤，以除去水虫。也可在50kg水中加漂白粉0.35g或漂粉精0.17g，但要除去余氯后才能使用。4、清洁工作一切用具每次使用后都必须刷洗3次以上，清洗后用6080的热水浸泡灭卵。5、每个粪检点必须用阳性粪便作对照，只有在阳性粪便孵出毛蚴，证明该粪检点具备毛蚴孵化条件，才能开展粪检。（六）提高阳性检出率的方法1、增加粪检次数增加粪检次数的前提是保证质量，不然，即使增加了检查次数，但实际上并没有提高阳性检出率。增加粪检次数确可提高检出率：对

48、155例已知粪检阳性者作复查，三送三检和六送六检的阳性检出率分别为85.8%和93.6%，还有6.4%未检出。又如1 687例病人的累计阳性检出率：三送三检、六送六检、七送七检分别为75.8%、96.0%和100.0%。2、湿育法用260目/25.4mm尼龙绢袋收集粪渣，把粪渣移到10×10cm的方形小尼龙绢袋，适当挤出粪渣中的水份，使呈团状，连同小尼龙绢袋放入塑料食品袋内，扎口，在2830下湿育24h，把小尼龙绢袋中的粪渣移入三角烧瓶内，加30温水，孵化12h。经比较，查103例，阳性检出率尼龙绢袋常规法为24.2%，尼龙绢袋湿育法为44.7%；毛蚴检获数，尼常法为428只，主要出

49、现在孵化后的8h和12h，尼湿法为983只，主要在1h、2h和3h。3、促孵法粪便10g，调浆，去粗渣，经尼龙绢袋集卵，将尼龙绢袋中的粪渣移入三角烧瓶，加水2530ml，在25下促孵6h20h，最后加水孵化，观察8h内孵出的毛蚴，重点是2h。经比较，检查110例，常规法的阳性检出率为10%，毛蚴总数156只，毛蚴主要出现在孵化后6h16h，而促孵法的3个相当值分别为12.7%、462只和2h4h。4、集孵法用尼龙绢袋收集粪渣，将粪渣浸于0.9%（指最终浓度）生理盐水中，在30下避光孵育2248h，取出粪渣倾注于尼龙绢袋内，滤去盐水，用清水稍洗，将粪渣冲入三角烧瓶内，在25左右孵化。在8h内观察

50、毛蚴3次，2h4h是重点。检查100例，两法共检出阳性40例，其中常规法检出28例，集孵法检出38例，常规法和集孵法均为阳性的有26例。表明集孵法能提高阳性检出率。三、沉渣镜检法沉渣镜检法和孵化法为国内常用的粪检方法。一般涂片镜检的量仅是沉渣的一部分，孵化则能利用全部沉渣，孵化法的阳性率要高于沉渣镜检法，所以目前不少疫区常以孵化法为主。但因各方面的原因，也有镜检查见虫卵而孵化为阴性者。从表7可以看出，孵化法阳性检出率要高于镜检，但尚不能取代镜检，通常在进行粪便检查时，要求沉渣镜检法与孵化法相结合。表7 粪便沉渣镜检和孵化的效果比较阳性总数镜检“+”孵化“+”镜检 孵化“+” “+”镜检 孵化“

51、+” “-”镜检 孵化“-” “+”份数%份数%份数%份数%份数%6826412560.4597887.6317146.495414.0280741.1（一）操作技术观察毛蚴后（毛蚴孵化的次日），缓慢倾倒三角烧瓶的水，使瓶内不发生气泡，最后使瓶底留下粪渣液约8ml。取下三角烧瓶颈部的粪检标签，取出试管架上的试管，将标签插入移去试管的试管架孔内。摇动三角烧瓶后，将其内的粪渣液倒入试管，将试管插入有标签的试管架孔内。静止约15min，倾去试管内的上清液，摇动试管，将其内的粪渣倒入2张载玻片上，并将其涂成2cm×4cm大小的薄膜，在低倍显微镜下检查虫卵。检查结果先登记在粪检标签上，待镜检告

52、一段落后，集中粪检标签，将检查结果登记于粪检花名册。（二）粪便中常见寄生虫卵形态1、日本血吸虫成熟虫卵大小为89（74106）×67（5580）m。成熟虫卵经过肠粘膜、大便，粘上杂质，故常可见到卵壳外有脏物附着。成熟卵近似圆形，淡黄色，壳的一侧有小棘，位于卵的中横线与顶端之间。在光学显微镜下，可见卵壳很薄，厚度小于1m，无盖。活卵中常可见毛蚴在活动，或只见其纤毛颤动或焰细胞的摆动。形成毛蚴后1011d，毛蚴即死亡，其结构逐渐崩解变性，轮廓慢慢变得不清，有些虫卵透光度渐次减弱，变成所谓“黑卵”，最后钙化。在卵的发育过程中，一部分未成熟即先后死亡，新的又不断产出，所以在一个病灶中或者进入粪便的卵群，可以有不同时期、不同大小、不同形态的死活卵。2、华枝睾吸虫（肝吸虫）卵虫卵在胆管内产出，随胆汁进入消化道混和在粪便中排出体外。虫卵产出后已成熟，里面含有毛蚴。虫卵呈黄褐色，略似电灯泡，顶端有盖，盖的两旁可见肩峰样小突起，底端有一个突起称疣。虫卵平均大小为29×17m，是粪便中最小的寄生虫卵。3、布氏姜片吸虫（