中心法则Crick

1、Chapter 6Transcription中心法则中心法则（Crick，1957） DNA RNA 蛋白质蛋白质转录转录(transcription)：以以DNA单链为模板，单链为模板，NTP为原料，在为原料，在DNA依赖的依赖的RNA聚合酶催化下合成聚合酶催化下合成RNA链的过程。链的过程。一、转录的基本特点：一、转录的基本特点：模板模板底物底物酶酶产物产物配对配对方向方向引物引物DNA的一条链的一条链( (不对称转录）不对称转录）NTPRNA聚合酶聚合酶mRNA, tRNA, rRNA，小，小RNAA-U,G-C5 3不需要不需要第一节第一节 概述概述二、转录、复制的不同点二、转录、复制

2、的不同点 1、转录时只有一条、转录时只有一条DNA链为模板，而复制时链为模板，而复制时 两条链都可作为模板；两条链都可作为模板； 2、DNA-RNA杂合双链不稳定，杂合双链不稳定，RNA合成后合成后 释放，而释放，而 DNA新链和母链形成子链；新链和母链形成子链； 3、RNA合成不需引物，而合成不需引物，而DNA复制需引物；复制需引物； 4 4、转录的底物是转录的底物是NTP，复制的底物是，复制的底物是dNTP； 5、聚合酶系不同。、聚合酶系不同。RNA聚合酶无校对功能。聚合酶无校对功能。三、转录单元三、转录单元（transcription unit）：）： 从启动子开始到终止子结束的从启动子

3、开始到终止子结束的DNA序列序列 转录起点转录起点 与新生与新生RNA链第一个核苷酸相对应链第一个核苷酸相对应DNA链上的链上的 碱基（通常为嘌呤：碱基（通常为嘌呤：A或或G）启动子启动子终止子终止子起点( -1)上游序列上游序列下游序列下游序列 (+1 )+1有义链有义链(编码链）编码链）反义链（模板链）反义链（模板链）RNA 四、模板链和编码链四、模板链和编码链1、模板链、模板链（template stand）-反义链反义链 作为转录模板的作为转录模板的DNA单链单链2 2、有义链、有义链（sense strand）-编码链编码链 非模板链，与非模板链，与转录产生的转录产生的RNA序列相同

4、序列相同第二节第二节 原核生物基因转录原核生物基因转录一、大肠杆菌一、大肠杆菌RNA 聚合酶（聚合酶（465 KDa） 全酶全酶 (核心酶核心酶 + ) 核心酶核心酶 ( 2 )rpoArpoBrpoCrpoD Catalytic centerEnzyme assemblypromoter recognitionPromoter specificity1、 亚基亚基 （1）分子质量：）分子质量：36.5 KDa （2）编码的基因：编码的基因： rpoA （3）功能：功能： a、对于核心酶的组装是必需的、对于核心酶的组装是必需的 b、与启动子的识别有关、与启动子的识别有关 （一）核心酶的组成和功

5、能（一）核心酶的组成和功能2、 亚基亚基（1）分子质量：）分子质量：151 KDa（2） 编码的基因编码的基因： rpoB （3）功能：）功能： a、与、与 亚基组成亚基组成RNA 聚合酶的催化中心聚合酶的催化中心 b、可与模板、可与模板DNA、RNA产物及核苷酸底物结合产物及核苷酸底物结合3、 亚基亚基（1）分子质量：）分子质量：155 Kda（2）编码的基因：）编码的基因：rpoC（3）特点：）特点： 结合两个结合两个 Zn 2+离子（离子（ Zn 2+可能参可能参 与聚合酶的催化功能）与聚合酶的催化功能）（4）功能：负责酶与模板）功能：负责酶与模板DNA的结合的结合4 4、核心酶、核心酶

6、( (core enzyme) )功能：功能： 催化核苷酸间磷酸二酯键的形成催化核苷酸间磷酸二酯键的形成 参与转录的全过程参与转录的全过程 思考：思考： RNA聚合酶如何找到聚合酶如何找到DNA上的一个上的一个特异性的启动子？特异性的启动子？ E.coli中不同的中不同的 因子可识别不同的启动子因子可识别不同的启动子(二二) 因子因子1、功能：在启动子的识别中起关键作用、功能：在启动子的识别中起关键作用2、 因子功能特点因子功能特点（1）可可提高提高RNA聚合酶对启动子区的亲和力聚合酶对启动子区的亲和力(103), 同时使核心酶对非特异性的同时使核心酶对非特异性的DNA序列的亲和力降序列的亲和

7、力降低低104倍倍（2） 因子负责因子负责模板链的选择和转录的起始模板链的选择和转录的起始（3） 因子因子不参与转录延伸过程，不参与转录延伸过程，在转录起始后从在转录起始后从 RNA聚合酶上释放出来聚合酶上释放出来 3 3、 因子控制起始因子控制起始（三）（三）RNA聚合酶执行多种功能聚合酶执行多种功能1、识别、识别DNA双链上的启动子；双链上的启动子；2、使、使DNA变性在启动子处解旋成单链；变性在启动子处解旋成单链；3、通过阅读启动子序列，、通过阅读启动子序列，RNA 聚合酶确定它聚合酶确定它 自己的转录方向和模板链。自己的转录方向和模板链。4、最后当它达到终止子时，通过识别停止转录、最后

8、当它达到终止子时，通过识别停止转录（四）（四）RNA 聚合酶功能特点（聚合活性）聚合酶功能特点（聚合活性）1. 其聚合过程不需引物其聚合过程不需引物 2. 5 to 3合成合成3. 需要需要 Mg2+ 激活激活4. 缺少缺少 3 to 5外切核酸酶活性外切核酸酶活性, 核苷酸错核苷酸错 配率配率 10-4to 10-5. 5. 通常是多亚基酶，合成各种类型的通常是多亚基酶，合成各种类型的RNA.6. 合成速率：合成速率：37oC ，40 nt /s 结合结合RNA 聚聚合合酶酶并并起起始始转录转录的的DNA 序列序列（一）位置和大小：（一）位置和大小： 1、位置：位于转录起点的上游，标记为负数

9、、位置：位于转录起点的上游，标记为负数 2、大小：长约、大小：长约40bp 二、启动子二、启动子promotor ( (E.coliE.coli) )启动子启动子终止子终止子起点( -1)上游序列上游序列下游序列下游序列 (+1 )+1*100种以上启动子的比较结果种以上启动子的比较结果-10T 80 A 95 T 45 A 60 A 50 T 96 (解旋的功能部位解旋的功能部位)-35T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A45 (启动子识别的功能部位启动子识别的功能部位)*共同序列共同序列TTGACATATAAT16 19bp5 9bp-35-10起始点起始点CTAGPrib

10、now box（二）启动子的基本结构（二）启动子的基本结构1、-10 sequence (Pribonow box)（1）在）在10位置存在位置存在 6 bp 保守序列保守序列（2）共有序列是）共有序列是 TATAAT. 其前两个碱基其前两个碱基 (TA) 和最后的和最后的 （T）是最保守的。）是最保守的。（3）是）是 70启动子中最保守的序列，是启动子中最保守的序列，是 RNA Pol 解开解开DNA螺旋起始转录的位置螺旋起始转录的位置附：附：-10-10序列对转录的效率影响序列对转录的效率影响1、TATAATAATAAT，转录效率下降，转录效率下降,称为称为 下降突变（下降突变（down

11、mutation）。）。2、TATGTTTATATT，转录效率上升，为，转录效率上升，为 上升突变（上升突变（up mutation）。）。2、 35 sequence:（1）在）在 35 位置附近有一段保守的六位置附近有一段保守的六 聚体序列。聚体序列。（2）其共有序列是：）其共有序列是： TTGACA（3）在E. coli 启动子中，其前三个碱基是最保守的启动子中，其前三个碱基是最保守的3、-10-10区和区和 35 区的间隔序列区的间隔序列（1）在90% 的启动子中，间隔序列为的启动子中，间隔序列为16-19 bp（2）间隔序列不保守）间隔序列不保守（3）间隔距离很重要）间隔距离很重要T

12、TGACATATAAT16 19bp5 9bp-35-10起始点起始点CTAGPribnow boxRNA 聚聚合合酶酶作用位点：启动子作用位点：启动子-35-35区、区、-10-10区区（三）启动子的效率：（三）启动子的效率：1、启动子的强弱：、启动子的强弱： RNA聚合酶通过启动子的时间代表一个聚合酶通过启动子的时间代表一个启动子的强弱，通过启动子的时间越短，启动子的强弱，通过启动子的时间越短，基因转录起始的频率越高基因转录起始的频率越高2、影响启动子效率的因素、影响启动子效率的因素（1）-10-10区：区：TATAAT（2 2） 35 区：区：TTGACA（3）-10-10区和区和 35

13、 区的间隔距离区的间隔距离（4）起始位点附近的序列可影响转录起起始位点附近的序列可影响转录起始始（一）起始（一）起始1. 启动子识别与结合启动子识别与结合2. DNA解旋（解旋（DNA unwinding）3. RNA链合成起始（链合成起始（RNA chain initiation）4. 因子释放因子释放三、原核生物基因的转录过程三、原核生物基因的转录过程DNA bindingClosed complexHoloenzyme三元复合物三元复合物Ternary complexDNA meltingOpen complexRelease of sigmaRNA synthesis beginsRN

14、A合成的起始合成的起始新生新生RNA69ntRNA synthesis initiation 转录的起始转录的起始1.启动子识别与结合启动子识别与结合：RNA聚合酶聚合酶在在DNA链上寻找启动子链上寻找启动子；全酶与与启动子区闭合双链结合，产生全酶与与启动子区闭合双链结合，产生封闭的酶封闭的酶-启动子二启动子二元复合物元复合物（closed binary complex）；）；2. DNA解旋解旋：在：在-10序列处，模板序列处，模板DNA局部变性，局部变性， DNA 解旋，解旋，形成形成开放的启动子二元复合体开放的启动子二元复合体；3. RNA链合成起始链合成起始：在：在起始位点起始位点+1

15、，聚合酶先掺入最初的两，聚合酶先掺入最初的两个核苷酸，形成一个磷酸二酯键。形成个核苷酸，形成一个磷酸二酯键。形成酶酶-启动子启动子-RNA三三元复合体元复合体（ternary complex）。）。4. 因子释放因子释放：新生：新生RNA达到达到69nt时形成时形成稳定的三元复合稳定的三元复合物物,因子释放。因子释放。附：流产起始附：流产起始(abortive initiation) 进行中的转录在一短寡核苷酸合成之后停止，进行中的转录在一短寡核苷酸合成之后停止，释放一个释放一个29碱基的寡核苷酸，聚合酶重新回到碱基的寡核苷酸，聚合酶重新回到起始位置，称为流产起始。起始位置，称为流产起始。 成

16、功的起始：成功的起始： 经常在模板上形成经常在模板上形成10个或更多的碱基后开始，个或更多的碱基后开始，聚合酶从启动子上游被清空。聚合酶从启动子上游被清空。Abortive initiation附：启动子清除附：启动子清除 当起始成功后，聚合酶释放出当起始成功后，聚合酶释放出因子因子；聚合酶离；聚合酶离开启动子以允许另一开启动子以允许另一RNA聚合酶再度起始转录。聚合酶再度起始转录。n启动子清除的最短时间是启动子清除的最短时间是12s，相对于转录的，相对于转录的其他步骤，这是一个较长的过程。其他步骤，这是一个较长的过程。（二）（二）RNA链的延伸链的延伸转录泡转录泡-DNA解开约解开约17bp

17、17bp1、延伸过程、延伸过程 随随RNA 聚合酶的移动，转录泡也行进，贯穿于聚合酶的移动，转录泡也行进，贯穿于延长的始终。延长的始终。 转录泡：转录泡：局部打开的局部打开的DNA双链，双链，RNA聚合酶及聚合酶及新生成转录本新生成转录本RNA局部形成的结构。局部形成的结构。2、延伸过程中的问题：延伸过程中的问题：（1）解旋和复旋解旋和复旋（2）拓扑学问题拓扑学问题（三）终止（三）终止1、终止子、终止子terminator ( (E.coliE.coli) ) 引起引起RNA 聚聚合合酶终止转录的酶终止转录的DNA序列序列（1）内在终止子（不依赖）内在终止子（不依赖 因子）因子）-强终止子强终

18、止子 特点：特点： a、终止位点上游有、终止位点上游有反向重复序列，富含反向重复序列，富含GC ， 3端有端有6个个A； b、转录产生的、转录产生的RNA 形成发卡结构、形成发卡结构、3端寡聚尿端寡聚尿 嘧啶嘧啶CAAAGCCCUAAGUUUCGGGAUUGCAAUUGGCCCGUUUUG-C 区区Poly(U)反向重复序列反向重复序列 7 20bpNNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNNNNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNN DNANNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNN RNA内在终止子内在终止子（2） 因子依赖性终止子因子依赖性终止子-弱终止子弱终止子特点：特点： a、GC含量少，无含量少，无多聚多聚dA序列序列 b、mRNA可形成可形成发卡结构，但发卡结构，但GC含量少，含量少， 发卡易打开，发卡易打开，3端无寡聚端无寡聚U 因子因子 识别序列：识别序列： RNA RNA 依赖性依赖性ATP 酶酶2、终止机制、终止机制 （1）内在终止子决定的转录终止）内在终止子决定的转录终止 （2）依赖）依赖因子的终止因子的终止RNA A-U配对（1）内在终止子决定的转录终止）内在终止子决定的转录终止 a a、发卡结