生物化学第15章核酸的研究方法

1、第第1515章章 核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法1 1、核酸的分离、提纯和定量测定、核酸的分离、提纯和定量测定一、DNA的分离： 真核生物中的染色体DNA常与碱性蛋白结合成核蛋白（DNP）形式存在于核内。 1）苯酚法： 用浓盐（1MNaCl）提取出DNP；用稀盐（0.14MNaCl）沉淀出DNP；用苯酚提取，除去蛋白质；冷乙醇沉淀出DNA；1 1、核酸的分离、提纯和定量测定、核酸的分离、提纯和定量测定一、一、DNADNA的分离：的分离：2 2）蛋白酶法：）蛋白酶法： 细胞悬液中加入含细胞悬液中加入含1 1SDSSDS的缓冲溶液的缓冲溶液 加入蛋白酶加入蛋白酶K K，6565C C保

2、温保温4h4h 苯酚抽提苯酚抽提 乙醇沉淀乙醇沉淀核酸的研究方法核酸的研究方法1 1、核酸的分离、提纯和定量测定、核酸的分离、提纯和定量测定二、RNA的分离： 因为Rnase无处不在而得RNA提取分离更为困难。 制备RNA应注意： 1）、所有玻璃器具都应高温灭菌；2）、破碎细胞时使用强变性剂，如胍盐，使酶失活； 3）、在RNA反应体系内加入RNA酶的抑制剂；1 1、核酸的分离、提纯和定量测定、核酸的分离、提纯和定量测定二、二、RNARNA的分离：的分离：目前最常用的RNA制备方法有两个： 1）用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提：少量制备RNA。 2）用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心：大量制备

3、RNA核酸的研究方法1 1、核酸的分离、提纯和定量测定、核酸的分离、提纯和定量测定三、核酸含量的测定：钼蓝比色法： 用浓硫酸或过氯酸将有机磷氧化成无机磷，在酸性条件下与钼酸生成磷钼酸，在还原剂存在下生成钼蓝，最大吸收在660nm处，从而可以比色测定。核酸的研究方法2、核酸的超速离心应用超速离心技术，可以测定核酸的沉降常数和相对分子质量，其基本原理与测定蛋白质的相对分子质量相同。分析DNA时，常用氯化铯密度梯度，密度梯度沉降平衡法常用于如下几个方面： 核酸密度测定 测定DNA中G-C的含量 溶液中核酸构象的研究 核酸的制备核酸的研究方法核酸的研究方法密度梯度沉降平衡法核酸的研究方法3 3、核酸的

4、凝胶电泳、核酸的凝胶电泳核酸常用的电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可在水平电泳槽也可在垂直电泳槽内进行电泳。以琼脂糖为支持物的电泳迁移率主要受下面因素影响：1）核酸分子大小；2）胶浓度；3）DNA的构象；4）电压；5）碱基组成；6）温度3 3、核酸的凝胶电泳、核酸的凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同： 相同点： 基本操作相同 影响因素相同 不同点： 分离分子量大小不同 适用对象不同 灵敏度不同 电泳槽类型不同 核酸的研究方法核酸的研究方法4 4、核酸的核苷酸序列测定、核酸的核苷酸序列测定（一）Sanger的酶法测序：反应体系包含单链模板、引物、四种dNTP和DNA聚

5、合酶。共分4组，每组按一定比例加入少量2,3双脱氧核苷酸。Frederick Sanger核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法自动DNA序列分析仪4 4、核酸的核苷酸序列测定、核酸的核苷酸序列测定(二)DNA的化学法测序：化学法的基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸。4种特异性反应有： G反应 G+A反应 T+C反应 C反应核酸的研究方法4 4、核酸的核苷酸序列测定、核酸的核苷酸序列测定Walter Gilbert核酸的研究方法核酸的研究方法毛细管阵列电泳毛细管阵列电泳基本步骤：设计引物优化体系选择热循环温度鉴定扩增产物核酸的研究方法5 5、DNADNA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）6、DNA的化学合成核酸的研究方法核酸的研究方法Questions CRISPR/Cas9技术原理及研究进展