分子生物学实验技术核酸的凝胶电泳

1、第一页，共41页。 前前 言言一、一、 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳三、三、 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳第二页，共41页。 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化用于分离、鉴定和纯化DNADNA或或RNARNA片段；片段； 优点：优点：（1 1）便于分离）便于分离; ;（2 2）便于检测）便于检测; ;（3 3）便于回收：）便于回收： 第三页，共41页。1 1）核酸分子之糖核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基团，呈磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化负离子化状态；核状态；核酸分子在一定的电场强度的

2、电场中，它们会向正电极方向迁移；酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；2 2）由于在电泳中往往使用由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质无反应活性的稳定的支持介质，电，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；系数是分子大小、介质粘度等的函数； 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。子。Home第四页，共41

3、页。第五页，共41页。第六页，共41页。第七页，共41页。第八页，共41页。 1 DNA 1 DNA分子的大小分子的大小 双链双链DNADNA分子迁移的速率与其碱基对数分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；的常用对数近似成反比； 2 2 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 第九页，共41页。 3 DNA3 DNA的构象的构象 一般同一分子：超螺旋环状线状一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。切口环状。 4 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）插入双链）插入双链DNADNA造成其

4、造成其负电荷减少、刚性和长度增加。负电荷减少、刚性和长度增加。第十页，共41页。 5 5 所用的电压所用的电压 低电压时低电压时DNADNA片段迁移率与所用的电片段迁移率与所用的电压成正比。压成正比。 6 6 琼脂糖种类琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；点琼脂糖；第十一页，共41页。 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/ 标准琼脂糖标准琼脂糖35389095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595 修饰的低

5、熔点修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖凝点琼脂糖253563653565 超低熔点超低熔点8154045 低黏性低熔点琼低黏性低熔点琼脂糖脂糖25307038853075第十二页，共41页。浓浓 度度（%）标标 准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低低黏度低溶点溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1第十三页，共41页。 7 7 电泳缓冲液电泳缓冲液 常用的有常用的

6、有TAETAE、TPETPE及及TBETBE第十四页，共41页。 都是常用电泳缓冲液。三者相比：都是常用电泳缓冲液。三者相比：1 1）TAETAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；胶的阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的

7、分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或TPETPE，对于，对于低分子质量的低分子质量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳分中的电泳分辨率要好于辨率要好于TBETBE。 第十五页，共41页。载样缓冲液：载样缓冲液：临上样到临上样到凝胶加样孔凝胶加样孔之前与待电之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程；3 3）其中的染

8、料在电场中以可以预测的泳动速）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。率向阳极迁移。第十六页，共41页。类型类型6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝溴酚蓝440% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液第十七页，共41页。 通过染色通过染色, 紫外灯下检测。紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭

9、（主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。第十八页，共41页。第十九页，共41页。第二十页，共41页。第二十一页，共41页。（1）EB被认为是一种被认为是一种强致癌物质强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸第二十二页，共41页。 （3 3）EBEB使用时的配制、贮存及使用使用时的配制、贮存及使用 EBEB常用水配制成常用水配制成10 mg/ml10 mg/ml的贮存液，于的贮存液，于室温保存在室温保存在棕色瓶棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为使用终浓度为0.5 g/ml0

10、.5 g/ml 。第二十三页，共41页。（4）当要知道当要知道DNA片段准确大小时，片段准确大小时，凝胶应在无凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结情况下电泳，电泳结束后再用束后再用EB染色。染色。第二十四页，共41页。 SYBR Gold SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商是一种新型极敏感染料的商品名称。其与品名称。其与DNADNA结合的亲和力高，并结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。且结合后，能够极大增强荧光信号。第二十五页，共41页。 可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶成像，染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。图像可以直接输出到计

11、算机观察。第二十六页，共41页。现一般采用试剂盒回收：现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题：存在的主要问题：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA Home第二十七页，共41页。第二十八页，共41页。第二十九页，共41页。 在在TEMEDTEMED ( (四甲基乙二胺四甲基乙二胺) 催化催化过硫酸铵过硫酸铵还原还原产生的自由基的存在下，产生的自由基的存在下，丙烯酰胺丙烯酰胺单体的乙烯单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如在双功能交联剂如N N，N-N-亚甲双丙

12、烯酰胺亚甲双丙烯酰胺的的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。能交联剂的浓度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质第三十页，共41页。CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺） 第三十一页，共41页。 1 1 变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链用于单链DNADNA片段的分离或纯化。片段的分离或纯化。 变性的

13、变性的DNADNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性用途：放射性DNADNA探针的分离、探针的分离、DNADNA测序反应等。测序反应等。第三十二页，共41页。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链用于双链DNADNA片段的分离和纯化。片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的用途：制备高纯度的DNADNA片段。片段。第三十三页，共41页。丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝

14、溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/301/30; ; Home第三十四页，共41页。第三十五页，共41页。为何选为何选PFGE？ 超过一定大小的线状双链超过一定大小的线状双链DNADNA分子在分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（极限长度（40kb40kb）后）后DNADNA的迁移速率几的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定

15、于电场乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但强度。但 PEGEPEGE 解决了这一问题。解决了这一问题。 第三十六页，共41页。（一）（一） PFGE 工作的基本原理工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。替进行的。DNADNA分子在交替变换方向的电场中作分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至该法可分离长至5Mb5Mb的的DNADNA分子。严格说来，应分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。叫交替电场凝胶电泳。第三十七页，共41页。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图第三十八页，共41页。 垂直脉冲场电泳系统垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统旋转胶系统(rotating gel) 箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field)第三十九页，共41页。A-+AB-+B垂直交变电场系统垂直交变电场系统场翻转系统场翻转系统箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统