脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用

1、脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用                             作者：刘明义，王胜春，赵慧萍【摘要】  目的探讨脂多糖（LPS）诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用。方法小鼠尾静脉注射（iv ）LPS 3.5mg/kg ，酶法检测3，6，12和24 h

2、小鼠血清ALT、 AST、 ALP、TRIG，化学法测定肝组织内MDA、NOS水平，免疫组化检测肝组织内TNF-，CD14，iNOS，eNOS的阳性表达率。结果与正常组比较,小鼠iv 注射LPS 后3 h血清ALT，AST水平明显升高并持续至12 h，24 h下降仍显著高于正常组，ALP水平明显持续下降。在12 h MDA含量显著升高，24 h下降但明显高于正常组，而甘油三酯（TG）水平各时间点明显升高，TNF-，CD14，iNOS，eNOS阳性表达率上调。五灵胶囊能明显降低ALT，AST水平和MDA含量，对ALP和 TRIG水平无作用，抑制肝组织内TNF-，CD14，iNOS，eNOS阳性表

3、达率。结论MDA，TNF-，CD14，iNOS，eNOS参与了LPS诱导肝损伤，五灵胶囊抑制LPS诱导肝损伤的作用机制与抑制活性递质生成有关。 【关键词】  肝损伤 一氧化氮合酶 活性介质 脂多糖Abstract：ObjectiveTo explore the change of mediator levels in hepatic injured mice induced by Lipoplysaccharide (LPS) and effects of Wuling capsule.MethodsLPS was given to mice by injection with a

4、dose of LPS 3.5mg/kg via the tail vein, 3,6,12,24 hours later, the levels of ALT, AST, ALP in serum were detected by enzyme method and the contents of MDA, NOS in hepatic tissue of mice were determined by chemistry, immunohistochemistry method was employed  to determine the expression of TNF-,

5、CD14, iNOS and eNOS in hepatic tissue. Results3 hours after LPS was given to mice, compared with normal group, the levels of ALT and AST were obviously elevated and persisted for 12 hours, and which were reduced in 24 hours but still high obviously as compared with normal group. The level of ALP wer

6、e evidently decreased, and the content of MDA was significantly increased at 6 hour and lowered at 24 hours but still higher than normal. The level of triglycerides was increased and the expression of TNF- , CD14, iNOS ,eNOS in liver injury tissue was markedly up-regulated.ConclusionThe mediators as

7、 MDA, TNF-, CD14, iNOS ,eNOS participated in liver injury induced by LPS, the protective mechanism  Wuling capsule liver injury might be related with inhibiting the release of mediators.    Key words：Liver injury;  Nitric oxide synthase;  Activity mediators; 

8、Lipoplysaccharid     内毒素血症与肝损害可互为因果，从而对肝病的发生发展及预后产生重要的影响1。脂多糖（lipopolysaccharide  LPS）致肝损伤机制诸多学者认为：主要是通过激活枯否细胞（Kupffer cells KC）释放细胞因子而介导肝细胞损害，LPS促进枯否细胞合成释放TNF-, 进而促进NO生成加重肝损伤2。早期研究表明五灵胶囊对LPS诱导枯否细胞释放细胞因子有明显抑制作用3，五灵胶囊具有疏肝健脾，扶正活血的作用，对内毒素血症肝损伤及介质TNF-，CD14，iNOS，eNOS表达有无影响还未经证实，本文对此进行

9、了观察，以便为临床用药提供依据。1  材料    动物：昆明种小鼠，雄性，体质量（25±2）g，中国人民解放军第四军医大学动物中心提供，动物合格证号：SCK(军)2002-05；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酯酶（ALP），甘油三酯（TG）,胆固醇(Chol)试剂盒（北京中生）；丙二醛（MDA）,一氧化氮合酶 （NOS）试剂盒（南京建成）； Rabbit anti-CD14，TNF-，NOS（iNOS），NOS（eNOS）一抗（武汉博士德）；S-P超敏试剂盒（福州迈新）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；五

10、灵胶囊（中国人民解放军第四军医大学西京医院药剂科提供，批号：20040122），称取五灵胶囊2 g，蒸馏水加热溶解至10 ml为经口给药供试液。2  方法2.1  LPS诱导小鼠肝损伤血清酶实验取昆明小鼠96只，随机分成3组（每组设4个时间点：3，6，12，24 h ）：正常组、LPS组、五灵胶囊组，每组每时间点8只。正常组和LPS组分别ig蒸馏水10 ml/kg，五灵胶囊组ig五灵胶囊2.0 g/kg，各组小鼠ig给药1次/d，连续给药5次，小鼠禁食自由饮水，末次给药2 h后正常组各时间点小鼠尾静脉注射(iv) 生理盐水2 ml/kg，其余2组各时间点小鼠iv LPS 3

11、.5 mg/kg，iv后分别于3，6，12，24 h眼眶取血，放置30 min，离心，分离血清，酶法测定TRIG，ALT，AST，ALP。2.2  肝组织内MDA、TRIG、 NOS测定和免疫组化实验迅速取上述实验小鼠肝脏剔去胆囊，用冰冷生理盐水洗去血渍，滤纸吸干水分，除肝大叶外的肝组织制成10%肝匀浆，10 000 r/min离心，取上清按试剂盒说明书测定MDA、TRIG、NOS：肝大叶用10%甲醛（0.01 mol/L）磷酸缓冲液固定48h，石蜡包埋、切片，脱蜡至水洗,分别与抗CD14、抗TNF-、抗iNOS、抗eNOS（1100）进行孵育，按试剂盒操作说明进行免疫组化反应，用二

12、氨基联苯胺（DAB）-0.3 ml H2O2 /L系统显色10 min。苏木素衬染、脱水透明后，中性树胶封片。阴性对照片用PBS替代一抗。结果评定：标本无明确阳性反应者为阴性，在40倍镜下以Miaspro图象分析系统程序扫描染色阳性细胞,每只小鼠肝组织扫描5个视野计数阳性细胞，结果以阳性细胞率表示。2.3  统计学处理采用SPSS10.0版统计软件，所测数据以（±s）表示，采用单因素方差分析。3  结果3.1  LPS诱导小鼠肝损伤不同时间血清酶的变化及五灵胶囊的作用血清酶学测试结果显示，小鼠 iv LPS后3 h血清ALT值上升最高，随着时间的延长其值

13、逐渐下降，在24 h ALT值有所降低但仍明显高于正常组，AST水平3 h升高，12 h达最高，24 h下降仍明显高于正常组；ALP 3 h明显下降，随着时间的延长其值下降更低。与LPS组比较，五灵胶囊组3h血清ALT和AST值高于LPS组，6 h与LPS组一致，12 h明显低于LPS组，24 h继续下降，五灵胶囊对LPS导致小鼠肝内ALP下降无作用。见表1。表1  肝损伤小鼠不同时间血清酶的变化及五灵胶囊的作用（略）3.2  对LPS诱导肝内MDA，TRIG，NOS含量影响小鼠iv LPS后3 h，与正常组比较，肝内MDA含量升高，12 h显著升高并达到高峰，24 h下降

14、但明显高于正常组(P<0.05)。小鼠LPS攻击后3 h肝内TRIG含量无变化，6 h TRIG值上升(P<0.05)，12 h达到最高，24 h下降但仍明显地高于正常组(P<0.05)。肝内NOS在3 h上升，12 h达最高(P<0.05)，24 h降至正常。与模型组比较,五灵胶囊组各时间点MDA含量均明显低于LPS组。对LPS诱导小鼠肝内TRIG和NOS含量增加无降低作用,见表2。表2  LPS诱导肝内 MDA，TRIG，NOS水平变化及五灵胶囊的作用（略）3.3  对LPS诱导肝内TNF-，CD14，iNOS，eNOS表达的影响免疫组化染色结果

15、显示，正常小鼠肝组织表达微量的TNF-，CD14，iNOS，eNOS，在不同的时间段内阳性表达率大致恒定。与正常组比较，小鼠iv LPS后不同时间点肝组织内TNF-阳性表达率持续急剧升高(P<0.05)；CD14在3 h阳性表达率最高，6 h有所下降，12 h和24 h又显著升高(P<0.05)；iNOS，eNOS阳性表达率高于正常值3倍，6 h和12 h下降，24 h显著升高。五灵胶囊在12，24 h可明显地降低TNF-， CD14，iNOS，eNOS阳性表达率。见表3。表3  LPS诱导肝内TNF-，CD14，iNOS，eNOS阳性表达的变化及五灵胶囊的作用（略）4&

16、#160; 讨论    以往研究显示LPS致肝损伤机制主要是通过激活 KC释放TNF-，IL-1，IL-8，PAF等细胞因子和介质诱导肝细胞损害，同时也引起肝细胞各种代谢功能改变。有研究发现体内注射LPS后肝细胞蛋白合成、糖代谢均受影响，最终可导致动物死亡。本试验显示小鼠iv LPS后3h，ALT和AST水平明显升高并持续至12，24 h下降但仍显著高于正常，ALP值则与前二者相反而明显地降低，随着时间的推移而逐渐降低，肝细胞损伤严重ALP值就愈低。小鼠iv LPS后3h肝内MDA，NOS和TRIG值升高并不显著，6、12 h 3指标含量明显增加，24 h MDA

17、和TRIG值仍高于正常组，NOS下降至正常。小鼠iv LPS 3h血清酶ALT与AST明显升高，表明肝细胞损伤开始，肝内MDA、NOS和TRIG并未急剧升高，提示在3h内反应肝损伤血清酶水平的上升与三介质无关；在6，12，24 h肝内MDA 、NOS 与TRIG值明显增加，血清ALT与AST水平也显著升高，肝内脂质代谢紊乱，提示在此时三者参与肝损伤。卞建明等4发现TNF-对肝细胞DNA的代谢呈双相调节，低浓度TNF-有刺激DNA合成的作用，而高浓度的TNF不但使DNA合成受阻，还造成肝细胞损伤，TNF-可通过抑制线粒体呼吸链复合物而使肝细胞能量代谢障碍5。CD14是KC表面存在的受体，在LPB

18、存在下CD14与LPS结合并迅速与细胞膜上其他具有信号转导能力的LPS相关受体如TLR2，2整合素、L-selectin等结合形成复合物，将LPS转递给这些信号转导分子介导KC激活分泌炎性细胞因子。诱导型NO合酶（iNOS）在生理情况下表达微量，只有在LPS和某些因子诱导下肝实质和非实质细胞才大量生成，从而产生持久的生理效应6。本实验显示组织中TNF- ，CD14，iNOS，eNOS 阳性表达率在324 h持续高表达，与肝功酶水平波动一致，肝组织iNOS、eNOS阳性表达率与肝内总NOS的结果趋向一致。提示这些因子与介质参与了肝损伤过程。五灵胶囊对3 h肝功酶酶水平无作用，至6 h逐渐影响LPS所致小鼠肝损伤，各肝功酶酶水平下降，至12 h产生明显的抑制作用，提示五灵胶囊并非直接作用血液内肝功酶而使酶水平下降，而是作用于LPS损伤肝细胞的某些环节而降低ALT和AST水平。ALP来自细胞器功能酶，五灵胶囊不能阻止ALP下降提示其对LPS所致细胞器损伤无作用。五灵胶囊在12，24h明显降低MDA和NOS含量，TNF-、 CD14、iNOS、eNOS阳性表达率下降，同时AST、ALT酶水平也相应下降，提示五灵胶囊抑制LPS所致肝损伤与降低炎性因子和介质有关。实验发现小鼠iv LPS后甘油三酯（TG）