肾缺血再灌注损伤中细胞凋亡和氧化应激

1、第卷第期Aug.2010（）文章编号：·论著·肾缺血再灌注损伤中细胞凋亡和氧化应激胡红林，王共先（1.南昌大学第二附属医院泌尿外科，江西南昌330006；2.南昌大学第一附属医院泌尿外科，江西南昌330006）（）过程中肾细胞凋亡情况与肾组织氧化应激反应水平。方法用摘要：目的探讨肾缺血再灌注损伤钳夹小鼠双侧肾蒂的方法建立肾动物模型，肾后检测肾功能，免疫印迹法分析肾组织中、和蛋白的表达情况，法分析肾小管凋亡情况，并作肾组织病理形态学检查。定量分析灌注后肾组织中总抗氧化能力（）和超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽还原酶（）、过氧化氢酶（）等抗氧化酶的变化。结果致肾功能明显损害，与对照

2、组相比，缺血组肾组织中激活的蛋白剪切片段和蛋白的表达升高，蛋白表达降低。法显示，肾小管细胞、凋亡明显增加。病理形态学显示，肾小管细胞出现片状坏死。肾脏病理组织学评分明显升高，肾组织降），而、及等抗氧化酶的变化无显著性（）。结论肾脏低，差异均有显著性（中肾小管细胞凋亡增加，总抗氧化能力降低，肾小管细胞凋亡和氧化应激是肾的重要机制。细胞凋亡；氧化应激；动物模型关键词：肾缺血再灌注损伤；中图分类号：文献标识码：Apoptosisandoxidativestressduringrenalischemia-reperfusioninjuryinBALB/cmiceHUHong-lin1,WANGGong

3、-xian2(1.DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Abstract:【Objective】Toexploretheroleofapoptosisandoxidativestressduringrenalischemia-reperfusioninjury（IRI）inBALB/cmice.【Methods】Renalarteriesofmicewerebilaterallyclampedwithmicro-arteryclampsfor45mintomakemodelofr

4、enalIRI.Theanimalsweresacrificedat24hpost-operatively.Renalfunction(serumcreatinineandbloodureanitrogen)andpathologyofthekidneyswereexamined.Theexpressionofcaspase-8,caspase-totalantioxidantcapacity(TAC)aswellassuperoxidedismutase(SOD),glutathionereductase(GSH),catalase(CAT)【Results】Comparedwithcont

5、rolgroupat24hafteroperation,levelsofserumcreatinineandweredetermined.bloodureanitrogenwereremarkablyincreasedinIRIgroup(P<0.01),typicalacutetubularnecrosiswithsevereinflammatorycellsinfiltrationwerefoundincorticomedullaryjunctionareaundermicroscope,histologicalscorefortubulardamageinIRIgroupwasmu

6、chhigherthanthatofcontrolgroup(P<0.01).Theexpressionofcleavedcaspase-8P20,caspase-3P11andbaxwasupregulatedsignificantlyandtheexpressionofbcl-2wasdownregulatedinIRIgroupcomparedwithcontrolgroupat24hafteroperation(P<0.05).TheTUNEL-positivecellswereincreasedsignificantlyinIRIgroup.RenalTACactivit

7、ywasreducedinIRIgroup(P<0.01).TherewasnodifferenceinthelevelofrenalSOD,GSH,CATbetweenIRIgroupandcontrolgroup(P>0.05).【Conclusion】TheapoptosisofrenalcellsisincreasedandrenaltotalantioxidantcapacityisdecreasedduringrenalIRI.ApoptosisandoxidativestressplayimportantrolesduringrenalIRI.Keywords:ren

8、alischemia-reperfusioninjury;apoptosis;oxidativestress;animalmodel收稿日期：通信作者王共先，：，：·2279·中国现代医学杂志第卷凋亡和氧化应激在器官缺血再灌注损伤（，）的发生、发展中起着本研究对小鼠肾时肾细胞重要的作用。凋亡情况与肾组织抗氧化活性的变化进行实验研究，以探讨肾的发生机制。法检测肾细胞凋亡上述石蜡包埋后的肾脏制作切片，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法（法）检测缺血组和对照组肾细胞的凋亡情况，具体步骤按检测试剂盒说明书操作（美国公司，产品目录）。在荧光显微镜下连续观察每张切片的个皮髓交

9、界处视野（×），计算阳性细胞数。免疫印迹法检测肾脏中凋亡相关蛋白表达将置于冰箱保存的肾脏取出，裂解后制作成细胞裂解液，考马斯亮兰法（法）行蛋白定量，每个样本取含总蛋白的细胞裂解液，采用常规法检测、和蛋白的表达，应用冷光影像分析仪（，日本公司）显像，以软体定量分析蛋白条带，并使用肌动蛋白（）作为内参照。所用抗体均购自美国公司。肾脏抗氧化酶活性和总抗氧化能力检测将置于冰箱保存的肾脏取出裂解后制作成蛋白悬液，考马斯亮兰法（法）行蛋白定量。采用化学比色法检测肾脏中超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽还原酶（）及过氧化氢酶（）的变化，采用终点比色法检测肾脏中总抗氧化能力（）。试剂盒均购自美国公司。统计

10、学处理应用统计软件进行统计分析，统计数据用均数±标准差±）表示，计量资料组间差异采用检验或非参数检验方法，计数资料组间差异采用检验。为差异有显著性。材料与方法实验动物清洁级雄性小鼠，周龄，体重，均由巴黎第五大学医学院附属医院免疫实验室提供，微型动脉夹由法国公司生产。肾模型小鼠术前禁食，应用三溴乙醇溶液（）腹腔内注射麻醉。肾缺血组：沿腹正中线做的切口，逐层分离皮肤、腹膜，进入腹腔，将肠道推向一侧，找到肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左、右肾蒂，可见肾脏由鲜红变紫黑双侧肾蒂阻断后，去除动色，表示夹闭成功。脉夹，恢复血流灌注，可见肾脏迅速由紫黑色变为鲜红，恢复原来颜色，术毕分层缝

11、合关闭腹腔。术后小补充水与饲料。术中鼠于的环境保暖，应用生理盐水使小鼠保持充分的水化。对照组（假手术组）：同法打开腹腔并找到肾蒂，但不夹闭肾蒂。血清生化指标检测和收集肾脏标本肾脏灌注后，经眼眶内眦静脉丛取血离心后吸取血清，检，、测血清肌酐（）和尿素氮（）。采血后引颈法处死小鼠，取出肾脏。其中个肾脏置于中性甲醛溶液中固定做病理组织学检测，另个肾脏用液氮迅速冷冻，置于冰箱保存以备后续相关检测。肾脏病理组织学检测肾脏行纵轴冠状面切开，置于中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，制作切片，常规染色，光学显微镜下观察肾小管坏死情况。每只小鼠肾脏切片随机选取皮髓交界处个视野观察，根据肾小管坏死程度，采用等的半定量病

12、理评估法评分：评分越高说明肾小管坏死越严重（最高分），分：正常肾脏，分：最少坏死（的肾小管坏死），分：轻度坏死（的肾小管坏死），分：中度坏死（的肾小管坏死），分：重度。坏死（的肾小管坏死）结果血清生化指标变化小鼠经历双侧肾脏缺血，再灌注后血清肌酐和尿素氮如图所示。缺血组的血清肌酐和尿素氮均明显升高，与对照组相比，差异有显著性（）。肾脏病理组织学评估对照组（假手术组）肾脏形态、大小及色泽正常；缺血组肾脏稍肿大，剖面见皮质苍白，髓质淤血暗红。染色光镜检查显示：对照组肾脏组织结构基本正常，仅见局部肾小管上皮细胞变性；缺血组肾组·2280·第期胡红林，等：肾缺血再灌注损伤中细胞凋亡

13、和氧化应激血清肌酐（）覮缺血组（）对照组（）织见大量小管上皮细胞肿胀、空泡变性，部分小管上皮细胞刷状缘扁平、皱缩、核深染及裸露。严重者可崩解脱落以及细胞核浓缩、碎裂及见上皮细胞坏死、核溶解。部分肾小管管腔扩张，坏死，崩解的上皮细胞可脱落入肾小管管腔内，呈模糊的颗粒样结构。病变往往呈片状或灶状。肾间质见炎性细胞浸润。再灌注后代表性染色图如图和所示。肾小管病理损伤评分结果如图所示。缺血组病理评分均显著高于对照组，差异有显著性（）。覮缺血组（）对照组（血清尿素氮（）法检测肾细胞凋亡缺血组肾细胞凋亡明显增加，法显示肾缺血再灌注后，缺血组肾组织中阳性细胞数（绿色荧光）明显增多，而对照组未见明显阳性细胞。

14、代表性的图片和阳性细胞计数如图、及所示。达缺血组和对照组肾脏中未活化的肾脏中和蛋白的表覮与对照组相比，图小鼠经历双侧肾脏缺血，再灌注后血清肌酐（）和尿素氮（）变化、蛋白表达无明显变化，而缺血组中活化的蛋白剪切片段（）、（）表达明显增加，与对照组相比，两组之肾小管病理损伤评分覮）缺血组（对照组（）阳性细胞数）（每×视野缺血组（）对照组（）、分别为缺血组和对照组肾脏染色代表性图片，箭头所示为肾小管片状坏死，为肾小管病理损伤评分。、分别为缺血组和对照组肾脏检测代表性图片，绿色荧光代表凋亡细胞核，为阳性细胞计数统计分析图。（×）（覮与对照组相比，）图小鼠双侧肾缺血，再灌注后肾脏病理

15、组织学评估和肾细胞凋亡间的差异有显著性（）（图）。肾脏中和蛋白的表达缺血组肾脏蛋白的表达明显降低，蛋白表达明显升高，与对照组相比，两组之间的差异有显著性（）（图）。肾脏中抗氧化活性与对照组相比，缺血组肾脏中、和的变化无显著性（）（图、）。相反，·2281·中国现代医学杂志第卷片段缺血组对照组缺血组对照组片段）缺血组（对照组（）（相对密度）（相对密度）缺血组对照组缺血组对照组片段（相对密度）覮（片数相对密度）（缺血组对照组缺血组对照组、为检测的代表性条带图片。、分别代表、和剪切片段、剪切片段（覮与对照组相比，）的条带经软体定量分析的条带密度与内参照的条带密度的比值的统计分析图

16、。图小鼠双侧肾缺血，再灌注后肾脏中、蛋白的表达缺血组对照组缺血组对照组（相对密度）（相对密度缺血组（）对照组（）缺血组（）对照组（）、为、及其各自内参照的检测代表性蛋白条带图片。、分别为和的条带经软体定量分析的条带密度与其内参照的条带密度的比值的统计分析图。）与对照组相比，；）与对照组相比，图小鼠双侧肾缺血，再灌注后肾脏中、蛋白的表达肾脏（·）肾脏（·）肾脏（·）肾脏（·）对照组（）缺血组（覮缺血组（）对照组（）缺血组（）对照组（）缺血组（）对照组（）覮与对照组相比，图小鼠双侧肾缺血，再灌注后肾脏中（）、（）、（）和（）的变化·2282

17、3;第期胡红林，等：肾缺血再灌注损伤中细胞凋亡和氧化应激总抗氧化能力（）明显降低，与对照组相比，两组之间的差异有显著性（）（图）。机制，发挥抑制凋亡的作用。有研究发现，蛋白能通过降低氧自由基活性和抑制氧自由基生成发挥抗氧化作用，还能维持线粒体的氧化功能。是促凋亡基因，能促进细胞因子缺失而诱导细胞凋亡，与可形成二聚体，两者的比例决定细胞向存活还是凋亡方向发展。等研究表明，大鼠肾后比值下降，通过腺病毒转染后，提高比值，可以很好地保护肾和抑制肾小管细胞的凋亡。等发现，基因敲除小鼠对各种氧应激特别敏感、细胞氧化损伤增加和抗氧化能力下降。本研究证明肾时肾脏蛋白表达下调，而蛋白表达上调，比值明显下降，从而

18、使肾细胞凋亡增加和抗氧化能力下降。有研究表明，能够裂解蛋白。在体外从过表达的细胞中发现，配体诱导细胞凋亡时，能在蛋白的环状区域处裂解蛋白，末端产物能触发细胞凋亡，裂解产物可进一步激活下游的，并导致级联反应放大。肾脏与活性氧（）的产生密切相关。缺血再灌注时机体大量产生，的大量产生，超过了机体的清除能力，使体内抗氧化活性被消耗，即可直接损伤组织和诱导细胞凋亡。本实验结果表明，与对照组相比，肾时虽然肾脏中、和等抗氧化酶的变化无显著性，但总抗氧化能力（）明显降低，其差异有显著性（）。等在大鼠肾模型中也发现，缺血组和假手术组肾脏、和等抗氧化酶的变化无显著性，而血清中的变化缺血组比假手术组明显降低，差异有

19、显著性（）。机体总抗氧化能力除了包括、和等抗氧化酶外，还包括一些具有抗氧化活性的非酶类大分子和小分子物质（如维生素、维生素、胡萝卜素、辅酶、白蛋白、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、尿酸和胆红素等）。本研究虽然缺血组与对照组抗氧化酶（、和）无明显变化，但可能缺血组的其他具有抗氧化活性的非酶类物质消耗降低，而使总抗氧化能力（）明显降低。根据本实验结果，肾过程中细胞凋亡增加和抗氧化能力降低。笔者认为，细胞凋亡和氧化应激是肾的重要机制，通过降低肾细胞凋亡或提高（下转第页）讨论肾脏为高灌注器官，对缺血及缺血再灌注均敏感。肾是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复及长期肾的病理生理

20、机制非常复杂，存活的主要因素。至今尚未彻底阐明。大量研究表明，细胞凋亡增加和自由基生成增多是肾的重要机制。本研究中，肾缺血组再灌注血清和水平明显升高，提示肾功能严重受损。另外，肾组织病理形态学显示肾小管明显坏死，阳性细胞计数明显增多，均说明肾模型成功建立。近年来，蛋白酶家族是细胞凋亡研究的热点，家族被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者。未活化的可分为启动因子（如和）和效应分子（如和），启动的激活能导致效应的激活。是最主要的效应，通过两种机制激活：死亡受体通路或线粒体通路。死亡受体通路是通过细胞表面的死亡受体与其相应的配体（如和）结合导致激活而发生；线粒体通路是通过细胞应激反应（如损伤，氧化应激）导致激活而发生。当通过或途径使激活时，活化的将被剪切成多个片段，这些剪切片段可以导致的断裂和细胞凋亡的一系列特征的形成。等在小鼠肾模型中发现，缺血组肾脏中和的表达明显升高，经干扰后抑制和的表达，可以较好地保护肾。本研究结果表明，缺血组和对照组的肾脏和的表达差异无显著性（），但剪切的片段