凝集试验四项

1、凝集试验四项第一页，共24页。凝集反应凝集反应v直接凝集反应直接凝集反应玻片凝集试验测玻片凝集试验测ABO血型血型试管凝集试验试管凝集试验v间接凝集反应间接凝集反应正向间接凝集试验测正向间接凝集试验测RF反向间接凝集试验测反向间接凝集试验测HBsAg间接凝集抑制试验测间接凝集抑制试验测HCG协同凝集反应协同凝集反应第二页，共24页。直接凝集试验直接凝集试验-测测ABO血型血型原理（玻片法）原理（玻片法）v天然的颗粒性抗原（如红细胞，白细胞，细天然的颗粒性抗原（如红细胞，白细胞，细菌等）与相应抗体在适宜条件下反应，出现菌等）与相应抗体在适宜条件下反应，出现肉眼可见的凝集物，称为直接凝集反应。玻肉

2、眼可见的凝集物，称为直接凝集反应。玻片法属于定性试验。片法属于定性试验。第三页，共24页。第四页，共24页。步骤步骤v取破片取破片1块，左上角和右上角分别标上块，左上角和右上角分别标上“A”和和“B”；v用采血针采指头血，将血滴在玻片的两头；用采血针采指头血，将血滴在玻片的两头；v在两血滴上分别滴上抗在两血滴上分别滴上抗A标准血清和抗标准血清和抗B标准血清，用牙标准血清，用牙签搅拌；签搅拌；v手持玻片，前后旋转摇动，促使血清与红细胞充分混合，手持玻片，前后旋转摇动，促使血清与红细胞充分混合，放置室温放置室温15min，用肉眼观察有无凝集。，用肉眼观察有无凝集。第五页，共24页。结果观察和判断结

3、果观察和判断v有凝集时红细胞相互聚集成团，出现大小不有凝集时红细胞相互聚集成团，出现大小不等的颗粒。等的颗粒。第六页，共24页。注意事项注意事项v玻片应洁净、干燥、中性，以防止和减少非玻片应洁净、干燥、中性，以防止和减少非特异性凝集。特异性凝集。v室温低于室温低于10时，易出现冷凝集而造成假阳时，易出现冷凝集而造成假阳性结果。性结果。第七页，共24页。间接凝集试验间接凝集试验v将将可溶性抗原（或抗体）可溶性抗原（或抗体）吸附于一种与免疫无关的、适当的大小的吸附于一种与免疫无关的、适当的大小的载体微粒载体微粒表面，再与相应抗体（或可溶性抗原）在适宜条件下表面，再与相应抗体（或可溶性抗原）在适宜条

4、件下相互作用，经一定时间出现肉眼可见的凝集现象，这种方法相互作用，经一定时间出现肉眼可见的凝集现象，这种方法称为间接凝集试验，又称被动凝集试验。称为间接凝集试验，又称被动凝集试验。v如将如将抗原抗原包被于载体微粒表面以检测抗体，称为（正向）间接凝集试包被于载体微粒表面以检测抗体，称为（正向）间接凝集试验；验；v如将如将抗体抗体吸附于载体微粒表面以检测抗原，则称为反向间接凝吸附于载体微粒表面以检测抗原，则称为反向间接凝集试验。集试验。v实验室常用的载体有实验室常用的载体有红细胞、胶乳颗粒红细胞、胶乳颗粒、活性碳、活性碳、SPA菌体等，菌体等，其中以红细胞为载体的间接凝集试验称为间接血凝试验，以其

5、中以红细胞为载体的间接凝集试验称为间接血凝试验，以胶乳为载体的间接凝集试验称为间接胶乳凝集试验。胶乳为载体的间接凝集试验称为间接胶乳凝集试验。第八页，共24页。正向间接凝集试验正向间接凝集试验测测RF原理（胶乳凝集试验）原理（胶乳凝集试验）v类风湿因子（类风湿因子（RF）是一组）是一组抗变性抗变性IgG的自身抗体的自身抗体，它，它能与人或动物的变性能与人或动物的变性IgG结合，而不与正常人结合，而不与正常人IgG发生凝发生凝集反应。根据这一点，将处理过的人集反应。根据这一点，将处理过的人IgG与羧化聚苯乙烯与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，使其吸附于胶乳颗粒载体上，称为致敏胶乳共价交联，使其吸附于胶

6、乳颗粒载体上，称为致敏的胶乳颗粒。当待检血清中有的胶乳颗粒。当待检血清中有RF是，则致敏胶乳颗粒上是，则致敏胶乳颗粒上的变性的变性IgG与相应的抗体（与相应的抗体（RF）发生反应，出现凝集现）发生反应，出现凝集现象。象。第九页，共24页。（正向）间接凝集反应原理示意图（正向）间接凝集反应原理示意图 第十页，共24页。步骤步骤v将阳性血清和阴性血清（用生理盐水稀释将阳性血清和阴性血清（用生理盐水稀释1：20倍稀释）倍稀释）1滴，分别加在玻片上，然后分滴，分别加在玻片上，然后分别加胶乳试剂一滴。别加胶乳试剂一滴。v轻轻摇动反应板（或用牙签充分混匀后），轻轻摇动反应板（或用牙签充分混匀后），23mi

7、n，观察结果。，观察结果。第十一页，共24页。结果观察和判断结果观察和判断v加入免疫胶乳试剂后，连续摇动，在室内的光线下加入免疫胶乳试剂后，连续摇动，在室内的光线下23min出现清晰凝集颗粒，且液体澄清者为阳性，即出现清晰凝集颗粒，且液体澄清者为阳性，即RF阳性。若需做定量测定，可将血清作倍比稀释，重复阳性。若需做定量测定，可将血清作倍比稀释，重复上述测定，以出现凝集的血清最高稀释度为上述测定，以出现凝集的血清最高稀释度为RF滴度。滴度。第十二页，共24页。反向间接凝集试验反向间接凝集试验-测测HBsAg原理（间接血凝试验）原理（间接血凝试验）v将抗体致敏红细胞与样品中相应抗原作凝集试验，观察

8、将抗体致敏红细胞与样品中相应抗原作凝集试验，观察红细胞凝集现象，用以判断样品中相应抗原的有无及其红细胞凝集现象，用以判断样品中相应抗原的有无及其效价。效价。 反向间接凝集反应原理示意图反向间接凝集反应原理示意图 第十三页，共24页。步骤步骤v在在“v”v”型孔微量反应板的型孔微量反应板的1212个孔中依次加入个孔中依次加入25l25l稀释液，用微量加样枪吸取阳性血清稀释液，用微量加样枪吸取阳性血清25l25l，将血清，将血清在在1212孔中依次稀释成孔中依次稀释成1 1：2 2 ，1 1：4 4 ，1 1：8 8 ，1 1：16 16 ，1 1：32 32 ，1 1：6464，1 1：1281

9、28，1 1：256256，1 1：512512，1 1：10241024，1 1：20482048，1 1：40964096，v在上述各孔中依次加致敏红细胞悬液在上述各孔中依次加致敏红细胞悬液25l25l，混匀（将板放，混匀（将板放在台面上打圈）在台面上打圈）1 12min2min，置，置3737温育温育1h1h，观察结果。，观察结果。第十四页，共24页。结果观察和判断结果观察和判断 v红细胞凝集强度分级红细胞凝集强度分级 ：红细胞沉积于孔底；：红细胞沉积于孔底； ：红细胞沉积于孔底，周围有散在少量凝集；：红细胞沉积于孔底，周围有散在少量凝集； ：红细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散；：

10、红细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散； ：红细胞形成片层凝集，面积略多于；：红细胞形成片层凝集，面积略多于； ：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边 缘皱缩如花边状缘皱缩如花边状v出现出现“+”+”以上凝集强度判断为阳性结果，以出现以上凝集强度判断为阳性结果，以出现“+”+”的的最高血清稀释度即为该血清中最高血清稀释度即为该血清中HBsAgHBsAg的滴度。的滴度。血凝反应强度示意图血凝反应强度示意图 第十五页，共24页。注意事项注意事项v器材必须十分洁净，否则对结果影响较大。器材必须十分洁净，否则对结果影响较大。v不能使用溶血、污染细菌的待检血清

11、，且待检血清中不能含不能使用溶血、污染细菌的待检血清，且待检血清中不能含待检者红细胞。待检者红细胞。v致敏红细胞浓度与试验结果的灵敏度成反比，其灵敏度以致敏红细胞浓度与试验结果的灵敏度成反比，其灵敏度以0.250.25致致敏红细胞悬液为最高，但不易观察结果，一般选用敏红细胞悬液为最高，但不易观察结果，一般选用0.50.5浓度为宜。浓度为宜。v加致敏红细胞悬液应先摇匀，以免影响灵敏度。加致敏红细胞悬液应先摇匀，以免影响灵敏度。v混匀不少于混匀不少于1min1min，以免因混合不均出现不清晰的凝集模式。，以免因混合不均出现不清晰的凝集模式。 第十六页，共24页。间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验测测

12、HCG原理原理v将含有可溶性抗原的待检样品先与已知抗体混合，充分将含有可溶性抗原的待检样品先与已知抗体混合，充分作用后再加入抗原致敏的胶乳颗粒，因抗体以与样品中作用后再加入抗原致敏的胶乳颗粒，因抗体以与样品中的可溶性抗原结合，胶乳颗粒不再出现的凝集现象，称的可溶性抗原结合，胶乳颗粒不再出现的凝集现象，称胶乳凝集抑制试验。本试验以检测绒毛膜促性腺激素胶乳凝集抑制试验。本试验以检测绒毛膜促性腺激素（HCG）的免疫妊娠试验为例。）的免疫妊娠试验为例。第十七页，共24页。第十八页，共24页。步骤步骤v将阳性尿、阴性尿（用生理盐水代替）、待检尿液分将阳性尿、阴性尿（用生理盐水代替）、待检尿液分别滴一滴在

13、玻片上别滴一滴在玻片上v然后分别滴一滴诊断血清（用然后分别滴一滴诊断血清（用HCG免疫动物得到的免疫动物得到的抗血清），分别用牙签搅匀，手持玻片，前后旋转抗血清），分别用牙签搅匀，手持玻片，前后旋转摇动一分钟摇动一分钟v在上述三滴上各加一滴胶乳抗原，用牙签混匀，在在上述三滴上各加一滴胶乳抗原，用牙签混匀，在轻摇轻摇23min，观察结果。，观察结果。第十九页，共24页。结果观察与判断结果观察与判断v阴性对照应出现明显的均匀一致的凝集颗粒，液体澄清，阴性对照应出现明显的均匀一致的凝集颗粒，液体澄清，否则试验无效。否则试验无效。v阳性对照应出现均匀一致的胶乳状，阳性对照应出现均匀一致的胶乳状，v待检

14、样品如出现明显的凝集为待检样品如出现明显的凝集为HCG阴性；如不出现凝阴性；如不出现凝集，呈均匀胶乳状为集，呈均匀胶乳状为HCG阳性。阳性。第二十页，共24页。注意事项注意事项v待检尿液以晨尿为好。待检尿液以晨尿为好。v试剂应试剂应44保存，切勿冻存，使用前将试剂平衡至室温并保存，切勿冻存，使用前将试剂平衡至室温并摇匀。摇匀。v试验同时设立阳性、阴性对照，以排除非特异性凝集。试验同时设立阳性、阴性对照，以排除非特异性凝集。v所加液滴应大小一致。所加液滴应大小一致。v结果应在强光下观察，观察时应在黑色背景下或将玻片稍倾结果应在强光下观察，观察时应在黑色背景下或将玻片稍倾斜。斜。第二十一页，共24

15、页。凝集四项的步骤凝集四项的步骤第二十二页，共24页。反向间接凝集试验测反向间接凝集试验测-HBsAg步骤步骤v在在“v”v”型孔微量反应板的型孔微量反应板的1212个孔中依次加入个孔中依次加入25l25l稀释液，用微量加样枪吸取阳性血清稀释液，用微量加样枪吸取阳性血清25l25l，将血清，将血清在在1212孔中依次稀释成孔中依次稀释成1 1：2 2 ，1 1：4 4 ，1 1：8 8 ，1 1：16 16 ，1 1：32 32 ，1 1：6464，1 1：128128，1 1：256256，1 1：512512，1 1：10241024，1 1：20482048，1 1：40964096，v在上述各孔中依次加致敏红细胞悬液在上述各孔中依次加致敏红细胞悬液25l25l，混匀（将，混匀（将板放在台面上打圈）板放在台面上