流式细胞术的原理和应用课件

1、流式细胞术的原理和应用细胞因子及免疫细胞功能检测细胞因子及免疫细胞功能检测(jin c)方法简介方法简介刘素侠刘素侠山东大学山东大学(shn dn d xu)(shn dn d xu)医学院免疫学医学院免疫学研究所研究所2011-2-23第一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用内内 容容 细胞因子检测的常用方法细胞因子检测的常用方法 免疫免疫(miny)(miny)细胞功能的常用检测方法细胞功能的常用检测方法第二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用一、免疫学检测一、免疫学检测(jin c)的基本原理的基本原理 抗原与抗体反应抗原与抗体反应(fnyng)的的特异性特异性是各种免疫学是

2、各种免疫学检测技术的基本原理检测技术的基本原理第三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用二、细胞因子检测二、细胞因子检测(jin c)方法方法 细胞因子的临床意义细胞因子的临床意义 常规测定法常规测定法 胞内细胞因子检测方法胞内细胞因子检测方法 细胞因子检测的主要临床细胞因子检测的主要临床(ln chun)(ln chun)应用应用 第五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（一）细胞因子的临床意义细胞因子的临床意义 细胞因子与疾病细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子表：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下达和分泌受

3、机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现细胞因子会出现异常性表达，表现(bioxin)(bioxin)为为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。 细胞因子与治疗细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：答调节剂。已批准生产：IFN-IFN-、，EpoEpo，GM-CSFGM-CSF，G-CSFG-CSF，IL-2IL-2，正在进行临床，正在进行临床试验的：试验的：IL-1IL-1、3 3、4 4、6 6、1111，M-C

4、SFM-CSF，SCFSCF，TGF-TGF-等等 第六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（二）常规检测（二）常规检测(jin c)方法方法 分子生物学测定法分子生物学测定法 生物生物(shngw)(shngw)活性检测法活性检测法 免疫化学测定法免疫化学测定法 第七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1.1.分子生物学测定法分子生物学测定法 是测定细胞因子是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要有的表达水平，主要有两种方法：两种方法： 分子分子(fnz)杂交技术杂交技术 多聚酶链反应技术（多聚酶链反应技术（PCR）第八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用分子杂交分子杂交(z

5、jio)技术技术 制备细胞因子的基因探针；制备细胞因子的基因探针； Northern 杂交或细胞原位杂交；杂交或细胞原位杂交； 优点：高度敏感和高度特异；优点：高度敏感和高度特异； 缺点：操作较繁琐缺点：操作较繁琐 测定结果只能代表细胞因子基因的表测定结果只能代表细胞因子基因的表达达(biod)(biod)，而不能代表活性细胞因子的水平。，而不能代表活性细胞因子的水平。 第九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用多聚酶链反应技术多聚酶链反应技术(jsh)（PCR） PCR（polymerase chain reaction)技术，是一种高技术，是一种高效的基因体外扩增技术；效的基因体外扩增

6、技术； 将细胞因子产生细胞的将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合提取出来，再经逆转录合成成cDNA，以，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行即可进行PCR扩增；扩增； 优点优点(yudin)：灵敏度高：灵敏度高 操作简便操作简便 缺点：缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。表活性细胞因子的水平。 第十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用PCR原理原理(yunl) PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周

7、期，循环(xnhun)进行，使目的DNA得以迅速扩增。 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：dsDNA ssDNA退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA 链 新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍第十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用5353变性变性(binxng)退火退火(tu hu)延伸延伸(ynshn)第二循环第二循环dsDNAssDNA加入引物加入引物5335dNTP, Taq酶酶535533355355第十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用反转录反转录(

8、zhun l)PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR)第十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RTPCR第十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RT-PCR反应反应(fnyng)过程过程反转录(zhun l)PCR： mRNA-cDNA-PCR抽提RNA 反转录合成cDNAPCR 扩增第十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RT反应反应(fnyng)体系体系 模板：总RNA，mRNA 引物：随机(su j)引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP) 逆转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcripta

9、se第十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用PCR反应(fnyng)体系 模板：逆转录产物cDNA 目的(md)基因特异性引物； 反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg+第十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用RT-PCR反应反应(fnyng)产物检测产物检测 凝胶电泳分析凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。 酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。 分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变 核酸核酸(h sun)序列分析（测序序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法第十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用实时荧光实时荧光(ynggung

10、)定量定量PCR(Fluorescence Quantified real time PCR) 与常规与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效相比，它具有特异性更强、有效解决解决PCR污染问题、自动化程度高等特点污染问题、自动化程度高等特点(tdin)，目前已得到广泛应用。，目前已得到广泛应用。第十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（1）原理原理(yunl)(yunl) 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术是指在技术是指在PCR反应反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个累实时监测整个PCR进程，最后通过标准进程，最后通过标准曲线对未知模板

11、进行定量分析曲线对未知模板进行定量分析(dnglingfnx)的方的方法。法。 第二十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1) 常用名词常用名词(mng c)概念概念 扩增曲线(qxin) 荧光阈值 Ct值第二十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用扩增曲线扩增曲线(qxin)第二十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用设定设定(sh dn)荧光域值荧光域值 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号； 荧光域值的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入(

12、jnr)指数期的最初阶段； 真正荧光信号：荧光信号大于阈值第二十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用荧光荧光(ynggung)阈值阈值（threshold）第二十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用Ct值值 Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数(csh) C代表Cycle（循环数） t代表threshold （荧光域值）第二十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用Ct值的确定值的确定(qudng)横坐标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强 度黑线：荧光域值红线：无模板 -域值下一 直线绿线 ：样品(yngpn)Ct值=17（第17个循

13、环时，荧光信号强度达到域值）第二十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用Ct值与起始值与起始(q sh)模板的关系模板的关系 研究研究(ynji)表明，每个表明，每个模板的模板的Ct值与该模板值与该模板的起始拷贝数的对数的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始存在线性关系，起始拷贝数越多，拷贝数越多，Ct值越值越小。小。 利用已知起始拷贝数利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准的标准品可作出标准曲线曲线第二十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（2）常用）常用(chn yn)标记方法标记方法 非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记： TaqMan Probe； 分

14、子(fnz)信标第二十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用SYBR Green I染料染料(rnlio)法法 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域(qy)的具有绿色激发波长的染料。第二十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用SYBR Green I染料染料(rnlio)法原理法原理第三十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用注意事项注意事项 因为SYBR Green I可以与所有(suyu)dsDNA结合而激发荧光，因此，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体，也可以同时被检测，将导致结果不准确； 关键：设计特异性引物关键：设计特异性引物！第三十

15、一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用结果判定结果判定(pndng)融解曲线融解曲线第三十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第三十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（3）qPCR结果分析结果分析相对相对(xingdu)定量解析定量解析第三十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1 1）相对）相对(xingdu)(xingdu)定量的必要性定量的必要性第三十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用必须用内对照必须用内对照(duzho)基因（管家基因）进基因（管家基因）进行校正行校正第三十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2 2）管家基因筛选）管家基因

16、筛选(shixun)(shixun) 管家基因：维持细胞生命活动代谢所必须的基因，如GAPDH, beta-Actin, 18s rRNA等； 筛选方法： 根据(gnj)文献提供； 通过具体实验。第三十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用3 3）分析方法）分析方法 双标准(biozhn)曲线法 2 - Ct法（Ct值比较法）第三十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1 1）双标准）双标准(biozhn)(biozhn)曲线法曲线法 通过标准曲线对对照样品、待测样品目的基因及管家基因进行定量(dngling)，然后根据公式计算相对值，即为相对表达量。 公式： 校正值(zhn zh

17、)目的基因定量结果管家基因定量结果相对值待测样品校正值对照样品校正值=校正值=目的基因定量结果校正值=管家基因定量结果目的基因定量结果校正值=对照样品校正值待测样品校正值对照样品校正值=待测样品校正值对照样品校正值相对值=待测样品校正值对照样品校正值第三十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第四十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用优缺点优缺点 优点：分析简单，实验优化相对简单；优点：分析简单，实验优化相对简单； 缺点：对每一个缺点：对每一个(y )基因，每一轮实验均需要基因，每一轮实验均需要做标准曲线；做标准曲线； 应用：基因表达调控研究应用：基因表达调控研究第四十一页，共一百

18、一十五页。流式细胞术的原理和应用2 2） 2 - Ct法法第四十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 2 - Ct法：假设目的基因、对照基因扩增效假设目的基因、对照基因扩增效率均是率均是100% Ct（处理前/对照组）=18-17=1 Ct（处理后/实验组）=16-17.4=-1.4 Ct= Ct（处理后）-Ct（处理前)=-2.4 比率(bl)（处理后/处理前）= 2 - Ct=2 - -2.4 =5.3 结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍 修正：扩增效率不是1，而是E， 2 - Ct可修正为（1+E） - Ct第四十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用优点优点(y

19、udin) 特异性好； 简单、安全、自动化程度(chngd)高； 速度快、高通量； 线性关系好、线性范围宽第四十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2. 生物生物(shngw)活性检测法活性检测法 测定细胞因子的生物学活性：刺激细胞增殖、维持细胞生长(shngzhng)和存活、抑制细胞生长(shngzhng)、溶解或杀灭细胞、抗病毒、促进细胞趋化、刺激细胞生成集落等活性； 指示细胞：多选用造血系统或淋巴系统细胞，最好用依赖性细胞株细胞； 显示细胞反应：用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。 第四十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（1）依赖性细胞株）依赖性细

20、胞株 一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些(zhxi)依赖细胞株检测相应的细胞因子； 优点：敏感性高，特异性强； 缺点：应用有限。 第四十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（2）功能）功能(gngnng)检测检测 利用一些细胞因子的功能特性，可建立(jinl)相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。 优点：敏感性高； 缺点：特异性不够，容易受一些扰因素的影响。 第四十七页，共一百一十五页。流式细胞

21、术的原理和应用A. 增殖增殖(zngzh)或增殖或增殖(zngzh)抑制法抑制法 其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些(mu xi)指示细胞的增殖，通过3H-TdR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。 第四十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用B. 集落形成集落形成(xngchng)法法 其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种(y zhn)或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。 第四十九页，共一百一十五页。流式细

22、胞术的原理和应用C. 直接直接(zhji)杀伤靶细胞杀伤靶细胞 细胞因子TNF-、TNF-具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以WEHI164亚克隆13（鼠纤维肉瘤细胞系）作为指示细胞，通过(tnggu)3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。 第五十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用D. 抗病毒效应抗病毒效应(xioyng) 靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击； 常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV），敏感的指示细胞为喉

23、癌的上皮细胞株Hep2和羊膜(yngm)的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-、IFN-、IFN-）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。 第五十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用E. 趋化作用趋化作用(zuyng) IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂(qingzh)趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。 第五十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用F. 抗体抗体(kngt)形成法形成法 IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生(chnshng)和分泌免疫球蛋白； 指示细胞：分泌IgG

24、的ARH-77、CESS 分泌IgM的SKW6.CL-4 方法：在一定条件下，待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关，通过标准IL-6的对照可推算出待检样品中IL-6的活性。 第五十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 IL-2的诱生及生物的诱生及生物(shngw)活性测定（试验四）活性测定（试验四）第五十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 一般一般(ybn)方法方法 细胞因子敏感的细胞株 细胞因子的标准品及待测品 指示剂：MTT，3H-TdR 酶联免疫吸附测定仪测定OD值 绘制标准曲线(qxin) 标准品50%最大OD值 找出与标准品50%最大OD值相

25、对应的标准品稀释度(S) 找出与标准品50%最大OD值相对应的待测品稀释度(A) 待测品单位数=S/A标准品单位第五十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用稀释(xsh)度OD值 1/8 1/4 S 1/2 A 1100%OD50%OD标准(biozhn)品待测品第五十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用对生物学活性测定法的评价对生物学活性测定法的评价(pngji) 优点：灵敏度高； 测定的是有生物活性的细胞因子 缺点：维持靶细胞株，操作繁杂和难定量(dngling) 特异性差 实验周期较长 易受其它因素的影响 第五十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用3. 免疫化学测定

26、法免疫化学测定法 用来检测细胞因子蛋白质的抗原特性，利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。 基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大(fngd)和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。 免疫标记技术免疫标记技术 第五十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 Radioimmunoassay Immunofluorescence第五十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用60第六十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（三）胞内细胞因子检测（三）胞内细胞因子检测(jin

27、c)方法方法 测定的是细胞因子的前体分子，是单一(dny)细胞行为； 一般要用先活化细胞，使之合成欲测细胞因子。在活化过程中加入蛋白质运输抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲尔德菌素A，阻止了细胞因子分泌，提高了胞内检测的阳性率； 检测方法：ELISPOT 荧光标记：荧光显微镜或FCM 第六十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用活化剂活化剂 活化(huhu)T细胞：除特异性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体A23187、T细胞受体抗体或CD3的抗体等； 活化B细胞：特异性抗原，脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素

28、A、B细胞受体抗体； 活化单核细胞：LPS和某些细胞因子。 第六十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞IL-17A流式检测流式检测(jin c)方法方法 第六十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 人外周血单个核细胞（PBMC ）的分离； 调整细胞浓度接种24孔板或96孔板； 加入Brefeldin A，PMA和ionomycin （离子霉素 ），进行细胞培养； 一定(ydng)时间后，收集细胞进行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、细胞内细胞因子染色、流式细胞仪测定和结果分析。 第六十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(

29、1) 抗凝抗凝静脉血静脉血(2) 加等加等量量(dn lin)NS(4) 密度梯度离心密度梯度离心(lxn)血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3) 混匀后，缓慢混匀后，缓慢(hunmn)加于分离加于分离液上液上第六十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 图图1. 表达表达IL-17和和IFN- 的的CD4+T细胞细胞(xbo)分析分析 图图2. CD4+T细胞表达转录因子细胞表达转录因子(ynz)FoxP3的检测的检测第六十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（四）细胞因子检测（四）细胞因子检测(jin c)的临床应的临床应用用 机体免疫状态的评估； 疾病预后及治疗监测

30、指标(zhbio)； 病理变化和损伤机理研究； 辅助诊断。 第六十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用三、常用免疫三、常用免疫(miny)(miny)细胞功能检测细胞功能检测方法方法评价机体的特异性和非特异性免疫评价机体的特异性和非特异性免疫(miny)功能功能第六十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用内容内容(nirng) 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞的功能检测 T T细胞功能检测细胞功能检测 B B细胞功能检测细胞功能检测 NK NK细胞功能检测细胞功能检测 吞噬细胞功能检测吞噬细胞功能检测 免疫细胞功能检测的临床免疫细胞功能检测的临床(ln chun)(ln chun)应用

31、应用 第六十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（一）淋巴细胞功能（一）淋巴细胞功能(gngnng)检测检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验；验； 体内实验主要是间接了解体内实验主要是间接了解(lioji)淋巴细胞对抗淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；原、半抗原或有丝分裂原的应答反应； 体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定巴细胞分泌产物的测定第七十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用淋巴

32、细胞淋巴细胞T细胞：介导细胞免疫细胞：介导细胞免疫(miny)B细胞：介导体液免疫细胞：介导体液免疫NK细胞：固有免疫细胞：固有免疫 第七十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第七十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1. T细胞细胞(xbo)功能检测功能检测 体外实验：T细胞增殖试验细胞增殖试验T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定(cdng)T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验. 体内试验体内试验第七十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（1）T淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖(zngzh)试验试验A.A.原理原理(yunl)(yunl)：淋巴细胞淋巴细胞DNA合成合成(

33、hchng)分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松第七十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小( (直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质

34、、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无第七十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用第七十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用B. 刺激物刺激物 特异性刺激物： 异种(y zhn)抗原：破伤风类毒素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD）和白色念珠菌 同种组织抗原：HLA 非特异性刺激物： PHA： 人人T细胞细胞 ConA：小鼠：小鼠T细胞细胞 PWM： T、 B细胞细胞 LPS： B细胞细胞第七十七页，共一百

35、一十五页。流式细胞术的原理和应用T细胞细胞(xbo)非特异性抗原刺激非特异性抗原刺激植物血凝素植物血凝素(PHA)-人人刀豆刀豆(do du)蛋白蛋白A(ConA)-小小鼠鼠淋巴淋巴(ln b)母细胞母细胞化化核酸、蛋白合成增加核酸、蛋白合成增加细胞体积增大细胞体积增大分裂、增殖分裂、增殖第七十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用常用常用(chn yn)方法方法第七十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用形态形态(xngti)计数法计数法外周血或分离外周血或分离(fnl)的淋巴细胞的淋巴细胞PHA涂片涂片(t pin)染色染色共培养共培养形态学观察形态学观察计算转化率计算转化率第

36、八十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率第八十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用方法方法(fngf)评价评价优点：简便易行，普通光学显微镜便能观察优点：简便易行，普通光学显微镜便能观察(gunch)(gunch)结果。结果。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。第八十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用同位素掺入法同位素掺入法外周血或分离外周血或分离(fnl)的淋巴细胞的淋巴细胞PHA共培养共培养DNA

37、合成合成(hchng)增增加加3H-TdR3H掺入到掺入到DNA中中液体液体(yt)闪烁仪检测信闪烁仪检测信号号第八十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用SIPHA刺激管刺激管cpm均值均值(jn zh)/对照管对照管cpm均值均值优点：敏感性高，客观性强，重复性好。优点：敏感性高，客观性强，重复性好。缺点缺点(qudin)：但需一定设备条件，同时还存：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题在放射性核素污染问题。第八十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用CCK8法法 (Cell Counting Kit 8)外周血或分离外周血或分离(fnl)的淋巴细胞的淋巴细胞PHA共

38、培养共培养DNA合成合成(hchng)增加增加CCK-8存活存活细胞细胞(xbo)(xbo)内线粒体脱氢还原酶内线粒体脱氢还原酶还原还原CCK-8CCK-8水溶性、黄色甲躦颗粒水溶性、黄色甲躦颗粒光密度值光密度值酶标仪第八十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用 MTT法法 CFSE染色检测染色检测(jin c)淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖第八十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(2) T细胞分泌细胞分泌(fnm)功能测定功能测定 体外培养的体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激细胞经各种丝裂原或抗原刺激后后,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞可借助免疫学、细胞生

39、物学及分子生物学技术分别检测细胞因子生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映含量、生物学活性或基因表达水平，以反映(fnyng)T细胞功能。细胞功能。第八十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(3)T细胞细胞(xbo)介导的细胞介导的细胞(xbo)毒实验毒实验 T细胞介导的细胞毒性是致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用。 评价机体细胞免疫水平； 测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一； 选用适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株，经培养(piyng)后

40、制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温一定时间，观察肿瘤细胞被杀伤情况。第八十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用A.原理原理(yunl)：靶细胞抗原靶细胞抗原(kngyun)(kngyun)T细胞细胞(xbo)观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTL靶细胞靶细胞第八十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法同位素法 ：淋巴细胞（：淋巴细胞（CTL）+含含51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 释放释放 测定测定(cdng)射线射线B.方法方

41、法(fngf)意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTL杀伤杀伤(shshng)肿瘤细胞的能力肿瘤细胞的能力 第九十页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用图图15-2 T15-2 T细胞细胞毒试验示意图细胞细胞毒试验示意图第九十一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（4 4）体内）体内(t ni)(t ni)试验试验特异性抗原特异性抗原(kngyun)皮肤试验皮肤试验PHA皮肤试验皮肤试验第九十二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用2. B细胞细胞(xbo)功能检测功能检测B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验B细胞抗体形成功能细胞抗体形成功能(gngnng)的检测的检测体内试验体内

42、试验第九十三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(1) B细胞细胞(xbo)增殖能力检测增殖能力检测抗抗IgM细菌细菌(xjn)脂多糖脂多糖SPAB细胞细胞(xbo)增殖增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法第九十四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（2）体外抗体）体外抗体(kngt)形成细胞检测形成细胞检测 微量溶血分光光度法测定抗体形成微量溶血分光光度法测定抗体形成(xngchng)细细胞胞QHS 溶血空斑实验 PFC液相小室法液相小室法 固相琼脂法固相琼脂法 ELISPOT检测特异性抗体形成细胞功能 第九十五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用溶血溶血(

43、rn xu)空斑试验空斑试验 又称为又称为PFC（Plaque forming cell）测定技术，是一种体外检测(jin c)单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。 分为直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验 ； 直接溶血空斑试验：测定产生 IgM 型抗体的细胞，只加细胞和补体 ； 间接溶血空斑试验：检测产生 IgG 或 IgA的细胞，加靶细胞、显斑剂、补体； 显斑剂：抗各类 Ig 高纯度的抗血清第九十六页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用原理原理(yunl)将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合

44、，在补体参与下，使抗体形成细胞周围参与下，使抗体形成细胞周围(zhuwi)(zhuwi)结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。见的溶血空斑。 第九十七页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素素(yn s)对体液免疫功能的影响对体液免疫功能的影响;评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。能力。第九十八页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用B细胞抗体细胞抗体(kngt)形成功能的检测形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑

45、点法第九十九页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用该方法既可检测抗体分泌细胞该方法既可检测抗体分泌细胞(xbo)，又可检，又可检测抗体分泌量。测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。第一百页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(4)(4)体内体内(t ni)(t ni)实验实验体内抗体产生的特异性抗原体内抗体产生的特异性抗原(kngyun)有白喉类毒素、破伤风有白喉类毒素、破伤风类毒素、

46、多价肺炎链球菌菌苗等。类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后疫后1周、周、2周、周、3周分别采血，分离血清，测定受检周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的细胞的功能。功能。第一百零一页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用染色染色(rns)(rns)计数计数离心离心(lxn)取上清取上清测测LDH或或AKP离心取沉淀离心取沉淀测活细胞测活细胞(xbo)荧光荧光测发光强度测发光强度测测CPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同

47、位素法同位素法化学发光法化学发光法3、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞: K562细胞株第一百零二页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用（二）吞噬细胞功能（二）吞噬细胞功能(gngnng)检测检测 吞噬细胞的吞噬活动大体分为吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化趋化、吞噬吞噬和和胞内杀灭胞内杀灭作用作用(zuyng)(zuyng)三个阶段，据此建立相三个阶段，据此建立相应的检测方法应的检测方法 中性粒细胞功能检测技术中性粒细胞功能检测技术 巨噬细胞功能检测技术巨噬细胞功能检测技术第一百零三页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用1.1.中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞的功能检测粒细胞的功能检测细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测(jin c)(jin c)吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测第一百零四页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用(1) 细胞细胞(xbo)运动功能运动功能趋化功能检测趋化功能检测原理原理(yunl)(yunl)：第一百零五页，共一百一十五页。流式细胞术的原理和应用方法方法(fngf)(fngf)：琼脂糖平板琼脂糖平板(pngbn)(pngbn)法法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法