酵母双杂总结

1、酯母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)o前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白一蛋白

2、的相互作用。主要有二类载体：a含DNA-bindingdomain的载体；b含DNA-activatingdomain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence),而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或竣基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147);LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-b

3、d编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reportergene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：1易于转化、便于回收扩增质粒。2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA结合结构域(如GAL4-bd,LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(

4、如GAL4-ad,VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。-GAL4ADGAL4DNABDRNAPolIImRNA醉母双杂交文库构建基本实验流程一第一链cDNA合成1 .准备高质量的PolyA或总RNA2 .在微量离心管中混匀以下试剂RNA样本(0.025-1.0闵polyA+或0.102.0闻总RNA)12d1.0MCDSIII12pl去离子水补齐体系到4.0d注：对照实验时，请使用1闻的对照RNA。CDSIII=Oligo-dT;CDSIII/6=随机引物3 .72

5、C,孵育2min。4 .冰上冷却2min,然后14000rpm,10s,瞬时离心。5 .混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。5XFirst-Strand缓冲液2.0MDTT(100mM)1.0MdNTP混合物(10mM)1.0MSMARTMMLV反转录酶1.0pl6 .42C,孵育10min。7 .加入16SMARTIIImodifiedoligo,混匀，42C,孵育1h。8 .75C,10min终止第一链合成反应。9 .室温冷却，加入1MRNA酶H(2U)。10 .37C,孵育20min。11 .继续进行LD-PCR扩增。二第二链cDNA合成

6、（LD-PCR）1 .建立两管100U1的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组，往实验组离心管中加入以下试剂并混合：第一链cDNA2d蒸储水70日10XAdvantage.2PCR缓冲液10日50XdNTP混合物2d5PCR引物2d3PCR引物2d10X溶解液10日50XAdvantage2聚合酶混合物2总体积100口30sec2 .扩增程序:95CxCycles95C10s68C6min68C5min3 .对每个1¥品取7MPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。三CHROMASPIN.+TE-400纯化柱纯化dscDNA1.将剩余的93ul的cDNA样品加入CHROMASPINTE-

7、400纯化柱中，颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀。移除顶端帽子，掰断柱底部的breakaway,将柱放置在2ml的收集管中。2.700rpm,5min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix半干。3.将将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上方加入93ul的样本。4.700rpm,5 min离心，样本便流到了收集管中。6 .将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀cDNA:加入1/10体积的3M醋酸钠。加入2.5倍体积的冰乙醇(95-100%)。t20,1hr放置沉淀。14,000,室温离心20min。弃上清，14,000rpm瞬时离心，去除残留的上清液。空

8、气干燥10min。7 .20日去离子水重悬cDNA,用于酵母文库构建。四建立Mate&Plate文库1 .遵循酵母转化系统文库规*II酵母转化操作，向0.5mlY187感受态中共转化下列组份：已纯化的dscDNA2芍囚pGADT7-Rec(0.50切6M2 .按照转化操作的第二步，将酵母重悬于15ml0.9%(w/v)NaCl中。3 .将100口的1/10、1/100稀释液分别铺板于SD/-Leu100mm固体培养基上，30C,孵育3Wd,确定文库的库容。4 .将剩下的悬浮液铺板于150mmSD/-Leu选择培养基上，每板100d悬浮液，约使用150板，30C孵育3-4d5 .收获St

9、ep4中的转化子：a.4C,3Yh冷却培养板。b.加入5ml的冻存液（YPDA/25%甘油）。c.使用无菌的玻璃珠分离菌落（缓缓地摇晃培养板，玻璃珠均匀地滚动于培养基表面将分离菌落，分离后的菌落溶于冻融液中）。d.将所有的液体收集于无菌的单管中（收集后的体积要达到0.5L）。e.用血球计数板来计算细胞密度，若细胞密度小于<2x107/ml,离心来减少悬浮液的体积。f.将文库分装到2ml的离心管中（1ml/管），-80C贮存。6 .取1ml单管文库进行筛选。醉母细胞感受态的制备及转化小样转化文库转化1在转化实验的两天前，于YPD培养基的平皿上活化酵母菌株（Y2H/Y187）。2 .转化前一

10、天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30,200rpm培养8-12h。50ml150ml3 .取5M上述酵母细胞液于50ml的YPDA培养基中，30C,200rpm培养8-12h至OD600>1.5。4.将上述酵母细胞液离心后转接到新的YPDA液体培养基中，使OD600=0.2,300ml1L30C200rpm培养4-6h,使OD600=0.5,0.125-50ml500ml5.700g离心5分钟收集酵母细胞，用无菌水或TE洗酵母细胞。6 .再次700g离心5分钟。7 .弃上清，用1.1灯E/LiAc重悬酵母细胞。8 .往离心管里加入如下试剂及DNA:?DNA-BD/

11、baita?AD/library?HerringtestescarrierDNA9 .加入感受态细胞，吸打均匀10 .加入PEG/LiAc缓冲液，高速漩涡混合11 .200rpm,30度孵育30min12 .加入DMSO,轻轻混合13 .42度,40min水浴14 .冰浴1-2min15 .室温高速离心(14000g)16 .弃上清，用1灯E重悬，进行涂皿操作1.5ml8ml0.10.21.0mg0.10.105mg0.1mg20mg0.1ml8ml0.6ml60ml70717.0ml5s5min0.5ml10ml醉母文库的筛选A诱饵质粒自激活活性检测和毒性检测1.诱饵载体和对照空载体转化酵母

12、Y2H细胞，取100仙除布SD/-Trp固体培养板，30°C倒置培养3-4天待菌落长出。2,挑(2-3mm)单克隆至50mlSD/-Trp液体培养基中，30°C摇床230-260rpm,16-24hr后，菌落PCR检测目的基因是否转入Y2H中，-70C保存阳性菌种。3 .将阳性克隆在SD/-Trp/X-gal(SDO/X)SD/-Trp/X-gal/Aba(SDO/X/A)平板上划线，30C倒置培养2天。4.观察有无蓝色菌斑的出现，菌斑不显蓝色则表明无自我激活活性；若实验菌斑与对照生长状况相同，则诱饵载体对酵母无毒。注：所需涂的皿及其生长结果如下表：sampleSelect

13、iveagarplate2mmcolonycolourY2HpGBKT7:baitSDOSD/-TrpYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/X-GalYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/X-Gal/AbaNOnoY2HpGBKT7:Lam+DDO/X-Gal/AbaNONOY187pGADT7-TY2HpGBKT7:53+DDO/X-Gal/AbaYesblueY187pGADT7-TB结合实验及筛库1.在冰上冻融1ml文库(酵母菌株>2x107cellsY187文库)。2.在2L三角瓶中，加入5ml含Y2H酵母菌(>1x109cells/ml目的蛋白

14、bait)的培养基和上述冻融的1ml文库。3,力口入45ml2XYPDA/Kan(50仙g/m)30-50rpm,30C,mating20-24小时，mating20小时后可取5n到显微镜下观察，如还没有结合子存在，再mating4小时，否则停止mating进入下面操作。4 .准备SD/Rde/His/-Leu/qrp(QDO)培养基平板，约150个(涂皿前应在超净工作台上吹2-3小时)。5 .转移mating体系至2个50ml离心管中，1000g室温离心10分钟，弃上清液。然后再加入2XYPDA洗一次酵母细胞，1000g室温离心10分钟，弃上清液。再用灭菌水清洗酵母细胞，两管合并，1000g

15、室温离心10分钟，弃上清液，加入约10ml灭菌水重悬酵母细胞。6 .涂皿，每平板加入150仙止述悬浮酵母细胞用玻璃珠涂开至无流动液体。7 .封皿后置于30c恒温生长箱，生长4-6天后，选取菌斑大于2mm的菌落，在QDO平板皿上划线，2-3d后长出的菌落可挑出来做插入片段扩增PCR。8 .将（7）中扩增片段大小不同（PCR验证3次，可大大降低假阳性菌落（约40%）的菌落于QDO、QDO/X-Gal和QDO/X-Gal/Aba培养基上划线（可适当增大X-Gal和Aba的浓度，以提高筛选的严谨性）,封皿后置于30c恒温生长箱，生长2-3d后观察生长状况。若在QDO上生长，QDO/X-Gal菌落变蓝，QDO/X-Gal/Aba不生长，则存在互作。将存在互作的菌落进行菌落PCR,将PCR产物送去测序，对测序结果进行分析，看是否存在与花粉的发育、能量传递和合成、核酸结合或者剪切、毒性蛋白等相关的基因。9 .挑互作酵母菌株至2ml2XYPDA中，30°C摇床230-260rpm,16-24hr,提取酵母质粒，再转入大肠杆菌中扩增含目的基因的载体，测序，到数据库中比对测序结果，标记感兴趣的互作蛋白。10.阳性克隆验证：抽出互作的酵母质粒后做