辣根过氧化物酶

1、辣根过氧化物酶（HRP一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁吓咻为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。简介：过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁吓咻结合

2、而成的糖蛋白，糖含量18%HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000，等电点为PHA9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%Z下饱和度硫酸俊溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ（德文ReinheitZahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途:1） RZ>3活性>250u/mg,主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B.2） RZ>2活性>180

3、u/mg,主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。3） RZ>1活性>100u/mg,主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。4） RZ>0.6活性>60u/mg,主要应用于尿液分析试纸。实验原理：过氧化物酶催化以下反应：2H2O2->O2+2H2O这一类酶以铁吓咻为辅基，所以属血红素蛋白质类（hemeProteins）过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步：第一步，形成绿色有活性的酶一底物复合物I:kHRP+HaOj宁夏管物I第二步

4、，复合物I转变成红色有活性的复合物H:复合物I+AH>复合物H+A（AH表示还原型氢供体。）第三步，复合物II被还原，释放出酶：K现含栅I*AH-一Uhrp*A*2HQ<3y在一定程度上复合物H可自发地分解成HRP和产物（P）,亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物mo复合物11>HRP+P&介物IIiH：O：红含物IH辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种，主要原理介绍如下：1、Rz值，提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度CD制Rz=ODj-r403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收结晶的HRP的Rz值为3.04。测定时的酶浓

5、度为1毫克蛋白/毫升。2、愈创木酚法：测k4见反应式（3）。以愈创木酚（邻甲氧基酚，guaiacol）为氢给体，其反应如下：L厂一li四邻甲氧基连酚有色产物四邻甲氧基连酚（E470nm=26.6mM1cm1）生成的速度（dx/dt）与底物过氧化氢以及氢供体愈创木酚的浓度有关。方程如下：Sue一酶浓度；a0一氢供体起始浓度；x0为过氧化氢的起始浓度。k1x0,可以测得k1:一测定过程中底物减少的速度。本实验是采用测定k4的方法来判断酶的纯度。上述测定Rz值和k4值的方法虽然比较简单，但都不能测得酶的实际活力单位。测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法，以过氧化氢为底物，在酶作用下，连苯三酚可形