酵母双杂交操作步骤中文翻译

1、（酵母菌储存在-70C中，引物和质粒DNA储存在-20C中）概念：1 .次序车t化：指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/baitplasmid）,在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ADfusionlibrary）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA,也就是节约质粒DNA。2 .共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。pGBKT7-的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7-的选择物是：ampicillin（氨茉西林）？各种SD培养基：1） SD/-ade（腺喋吟）/-leu（亮氨酸）/-trp“四缺”）酵母氮源

2、（YNB：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.60g葡萄糖20g（即2%）2） SD/-leu/-trp/-his（1000ml）酵母氮源（YNB：6.7g;-leu/-trp/-hisDOsupplement0.62g;葡萄糖20g.（即2%）3） SD/-leu/-trp（1000ml）（?“二缺”酵母氮源（YNB>:6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.64g葡萄糖20g（即2%）（色氨酸）/-his（组氨酸）（1000ml）（?（购买来就配好的）；（购买来就配好的）（购买来就配好的）4） SD/-leu

3、（1000ml）酵母氮源（YNB>:6.7g;-leuDOsupplement0.69g;（购买来就配好的）葡萄糖20g（即2%）5） SD/-trp（1000ml）酵母氮源（YNB>:6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.74g;（购买来就配好的）葡萄糖20g（即2%）注意：YNBW两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸钱的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸钱，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸钱，即最终在1000ml溶液中加入总量为6.7g的YN。硫酸俊。实际配制的方法是：1 .配制40%勺葡萄糖

4、贮存液（贮存在4C）,过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55C以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（过滤即可使用）2 .酵母氮源6.7g,力口DOsupplement在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10MNaOH200ul即可），之后补水至950ml。3 .高压完后待温度降至55c以下，加入50ml40%葡萄糖。YPDW养基（1000ml）20g/L蛋白月东10g/L酵母提取物20g/L琼脂（只有制作平板才用）20g/L葡萄糖（即2%）1xYPDA培养基（1000ml）20g/L蛋白月东10g/L酵母提取物0.03g/L腺喋吟（即终浓度为0.003%）腺喋吟可以耐受高温20g/L

5、葡萄糖（即2%）实际配制的方法是：1 .配制40%勺葡萄糖贮存液（贮存在4C）,过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55C以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2 .配制0.2%的腺喋吟溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55c以下时，再将15ml腺喋吟溶液加入。（或将腺喋吟直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3 .（蛋白月东20g;酵母提取物10g;水大约925ml）混合后，调至PH至6.5,加水至935ml,121c高压15min。高压的温度和时间不能太长与太高，121c高压15min即可。可以在YPDA中力口入20g/L的琼脂，以配成平板

6、。需要加kanamycin时，kan终浓度是10-15mg/L。（kanamycin可以20c贮存一个月,加入到平板中去可以4c贮存一个月。）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列贮存液来配制50%PEG3350:用灭菌水配，如需要可以加热至50c以助溶。10XTEbuffer:用灭菌水配，如需要可以加热至50c以助溶。10XLiAc:用灭菌水配，如需要可以加热至50c以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1X1mlof10XTELiAc1X1mlof10XLiAc无

7、菌1xTE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）10xTEbuffer:0.1MTris-HCl,10mMEDTA,pH7.5（高压）10xLiAc:1M用稀醋酸调节PH至7.5高压ForB-galactosidase滤膜实验Zbuffer溶液:W2HPO4?NaH2PO4?7H2OH2OKClMgSO4最后调?7H2OPH至7.0,16.1g/L5.50g/L0.75g/L0.246g/L（如换Na2HPO4?（如换NaH2PO4?高压，室温下可以贮存1年14H2。则20.739g/L）2H2O贝U6.21g/L）X-gal溶液:X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20mg

8、/ml.,N0避光保存Zbuffer/X-gal溶液：100mlZbuffer0.27ml3-mercaptoethanol（伊疏基乙醇）1.67mlX-gal贮存液ONPG容液：（即配即用）ONPG溶于Zbuffer中，终浓度4mg/ml，调PH至7.0.注意：1 .ONPG需要12h才能溶解2 .每次用之前新鲜制备。带有B-航基乙醇的Zbuffer将0.27ml3-疏基乙酉I加入100mlZbuffer中即可为了转化成功的小提示：1 .用一个13周龄（直径23mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径v2mm,就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。）2 .如果过夜或者3hr

9、之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。3 .当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。4 .为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。5 .当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。一般BD是AD的两倍。（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）6 .为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板

10、用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shaketheplatebackandforthnotroundandround.（科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）1 .复苏酪母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。（接种的时候采取四区分区画线法）2 .酯母感受态细胞置备和转化步骤：1 .取直径23mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。2 .剧烈振荡或涡旋5min,使所有团块分散开来。3 .转移酵母液到50mlYPD（?固体一一也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。4 .置于30c摇床中，以250rpm的转速震荡培养基1618h,直到OD600&g

11、t;1.55 .转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600在0.2-0.3之间。6 .30C摇床以230rpm的转速震荡培养基34h直至OD为0.40.6.（IftheOD600is<0.4,somethingiswrongwiththeculture）7 .转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（2021°C）离心5min8 .弃去上清，加入2550ml无菌水或无菌的1xTE重悬酵母。9 .在1000g室温（2021°C）条件下离心5min10 .轻轻倒出（弃去）上清11 .将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1x

12、TE/1xLiAc（在实验开始之前置备）（至此酵母感受态细胞制备完毕）12 .向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲜鱼精载体DNA,之后轻轻混匀。13 .再向每管中加入0.1ml酵母感受态细胞，并且震荡混匀。14 .向每一管加入600ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。15 .30C摇床以200rpm的转速振荡培养30min16 .向每一管加入70ulDMSO轻轻颠倒混匀，不要震荡。17 .42C水浴热激15min18 .取出后在冰上冷却1-2min19 .1000rpm室温离心5min,弃去上清。20 .用0.5ml无菌的1XTE重悬酵母。21 .取合

13、适体积的菌液（一般是100ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30c培养箱中培养2-4天。（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/-His/-Leu/Trp,1/3涂在SD/Rde/4His/-Leu/口rp,最后1/3涂在SD/-Leu/干rp上。）（科内仅涂布二缺与四缺板）（在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个“-gal实验。如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。如果酵母能生长的话就接着做一个3-gal。所以有的人同时转化两种菌种。这样

14、就完全可以确定两蛋白是否有作用了。之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。三.a和B-gal实验：（我就做B-gal试验，要注意如果做B-gal的话，这时候菌种要换成Y187,而不是之前的AH109（在protocol的2428页）1 .试齐1J：2 .原理：ONPG为无色物质，在3-半乳糖昔酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol（硝基苯酚）,在420nm（OD410）处有光吸收。Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。（Na2CO3在配制时，不需要高压）3 .实验方法一.Colony-liftFilterAssay（滤膜分析或滤膜

15、试验）（这是定性试验）a）将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30c培养2-4天。b）准备Zbuffer/X-gal溶液。c）为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman滤纸，置于100mm或150mm无菌平板中用2.5-5mlZbuffer/X-gal溶液浸泡。d）用无菌的镣子小心地将无菌Whatman滤纸覆盖到平板表面，要使所有的待测菌株都有部分沾到滤纸上。e）用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔，以标志方向。f）滤纸放入液氮中0.51min至结冰，之后再放置于室温融化，如此反复冻融3次。g）小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上，有菌株一面向上，注意

16、两层滤纸中间不要有气泡。h）平板放到30c培养箱中，观察其是否变蓝。一般阳性克隆在0.58h内会变蓝，超过8h容易产生假阳性结果。二.LiquidCultureAssay（以ONPG为底物的液体培养法）（这是定量试验）1） 在合适的SD培养基中制备5ml过度培养物。注意：你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。2） 在进行实验当天，将ONPG以4mg/ml的浓度溶于Zbuffer中，振荡12h确保完全溶解。3） 大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块，立即转移2ml（0.5ml）过夜培养基物到8ml（2ml）YPD培溶液中。（以25%的含量加）4） 30c培养35h（230-250rp

17、m）直至细胞进入对数生长期（1ml溶液的OD600应在0.5-0.8之间）在收获细胞的同时记录OD600值。注意：在检测OD值的时候，涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块5） 各吸取1.5ml（0.5ml）培养物到各3个1.5ml离心管（每个管子就是1.5ml）,离心14000rpm/30sec。6） 小心移去上清，加上1.5ml（0.5ml）Zbuffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。7） 再次离心并移去上清，加上300ul（100ul）Zbuffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。这样，终浓度就是1.5/0.3=5倍。注意：在这个清洗步骤之后，细胞收获物的差异可以通过再次读取OD600值来

18、纠正。8） 转移0.1ml细胞悬液至新的离心管中。9） 将细胞置于液氮中（约0.51min）直至细胞冰冻。10）将离心管放于37c水浴中0.51min使其融化。11）反复冻融3次（重复9和10步）确保细胞裂解。12）用100ulZbuffer.来设置一个空白对照。13）力口0.7ml的Zbuffer与3-疏基乙醇到反应管和空白管中注意：在冰冻之前不要加Zbuffer14）立即加160ulONPG（溶于Zbuffer中）至各反应管和空白管中，开始计时。15）将各管放入30c水浴中。16）待出现黄色后，力口0.4ml的1MNa2CO3至各反应管和空白管中，以分钟计算消退时间。注意：需要的时间可能会变化，（对于单个的3-gal阳性对照质粒约需315min,对于双杂交阳性对照约30min,弱的反应可能需24h.）黄色不稳定，并且随时间延长可能加剧。每一批需要做一个新的空白管。17）14,000rpm离心10min,以除去细胞碎片。18）仔细小心转移上清到清洁比色杯中。注意：如果上清中若混有细胞碎片，将严重干扰本