猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定

1、猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定、实验目的1、掌握等电点沉淀、盐析及离子交换层析原理及操作。2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程。3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术二、实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。猪胰蛋白酶的分子量约为23400,其等电点约为pH10.8,最适pH7.68.0,胰蛋白酶在pH3条件下较稳定，在pH5以上易自溶，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不

2、发生明显的改变。本实验以猪胰脏为材料，首先用酸性水溶液抽提组织，在Ca2+离子存在条件下，以少量胰蛋白酶结晶激活所得的酶原，再以硫酸钱盐析获得粗胰蛋白酶。经过透析除盐，以竣甲基纤维素柱阳离子交换层析进行纯化，即可获得较纯的胰蛋白酶。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)的竣基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和竣基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键>酰胺键>肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。本实验以酪蛋白为底物的方法来

3、测定胰蛋白酶活力，其主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收值做对照，根据酶活力蛋白的定义，确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1仙mol酪氨酸在280nm处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位(U)。三、试剂和器材1、试剂：(1)pH2.5乙酸酸化水：在酸度计监测下，向蒸储水中加入乙酸，使pH达2.5。(2) 10%(V/V)HAc溶液(3) 2.5mol/LH2S

4、O4(4) 5mol/LNaOH(5) 2mol/LHCl(6) 0.001mol/LHCl(7) 0.01mol/L,pH5.0,柠檬酸钠缓冲液：量取41mL0.01mol/L柠檬酸溶液(2.10gH3c6H5O7-H2O/L),加入59mL0.01mol/L柠檬酸钠溶液(2.9gNa3c6H5O7-2H2O/L)混匀，用酸度计检查pH值是否为5.0。(8) 0.05mol/L,pH5.0,柠檬酸钠缓冲液：量取8.2mL0.05mol/L柠檬酸溶液(10.5gH3c6H5O7H2O/L),加入11.8mL0.05mol/L柠檬酸钠溶液(14.705gN%C6H5O7-2H2O/L)混匀,用酸

5、度计检查pH值是否为5.0。(9) 0.1mol/L,pH6.0,柠檬酸钠缓冲液：量取19mL0.1mol/L柠檬酸溶液(21gH3c6H5O7H2O/L),加入81mL0.1mol/L柠檬酸钠溶液(29gNa3c6H5O72H2O/L)混匀，用酸度计检查pH值是否为6.0。(10) 8%三氯乙酸(11) 10mg/mL酪蛋白溶液：取酪蛋白1g,加13mL0.5mol/LNaOH溶液，0.1MTrisHCl缓冲液，pH8.040mL,置85c水浴加热至溶解，放至室温后，加上述缓冲液40mL,用1NHCl小心调pH为8.0,用缓冲液定容至100mL。(12) 不同pH值缓冲液的的配制I0.1M磷

6、酸缓冲液：pH6.0、6.5、7.0、7.5a. 0.1M磷酸氢二钠的配制：称取Na2HPO412H2O(358.14g/mol)17.9070g加水定容至500mLb. 0.1M磷酸二氢钠的配制：称取NaH2P042H2O(156.01g/mol)7.8005g加水定容至500mLc.二者互兑至相应pH值n0.1MTrisHCl缓冲液：pH8.0、8.5、9.0称取Tris12.11g力口入水60mL用3NHCl调至所需pH加水定容至100mLm0.1MNaCO3NaHCO3缓冲液：pH9.5、10.0、10.5a. 0.1MNaCO3的配制：称取NaCO35.2995g加水定容至500mL

7、b. 0.1MNaHCO3的配制：称取NaHCO34.2005g定容至500mLc.二者互兑至相应pH值(13) SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)所需试剂(无需配制)30%储备胶溶液：将29.0g丙烯酰胺(Acr)和1.0gN-N'亚甲双丙烯酰胺(Bis)溶于60mL水中，于37c溶解，定容至100mL,棕色瓶存于室温。 1.5mol/LTrisHCl(pH8.8):Tris18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.8,定容至100mL。 1.0mol/LTrisHCl(pH6.8):Tris12.11g力口ddHzO溶解，浓盐酸调pH至6.8,定容至100mL。10%SD

8、S:电泳级SDS10.0g加ddH2O68c助溶，浓盐酸调至pH7.2,定容至100mL010%过硫酸俊（AP）:100mgAP加ddWO至1mL。TEMED采用原包装液，4c保存。 10Mt泳缓冲液（pH8.3）:Tris3.02g,甘氨酸18.8g,10%SDS10mL加ddH2O溶解，定容至100mL。 4XSDS电泳上样缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH6.8）,8%SDS,0.4%澳酚兰1.0ml,40%甘油考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝（R-250）0.25g,甲醇225mL,冰醋酸46mL,ddH2O225mL。 脱色液：甲醇、冰醋酸、ddH2O以3：1：6配制而成。

9、2、材料新鲜或冰冻猪胰脏3、仪器组织捣碎机、高速冷冻离心机、磁力搅拌器、透析袋、分析天平、蛋白质柱层析系统、恒温水浴锅、电泳仪、电泳槽、计时器、pH计、凝胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。四、实验方法1 .猪胰蛋白酶的分离纯化（1）粗猪胰蛋白酶的提取取猪胰脏，除去脂肪和结2S组织，切碎，称重约50g3加入5倍体积预冷的pH2.5乙酸酸化水I用组织捣碎机捣碎离心10000rpm,15min用4层纱布过滤得上清液（收集约1.5mL,作为留样1,测蛋白含量，及时SDS化）将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀，使溶液中最终含有0.1mol/LCaCl2加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg）

10、,轻轻搅拌均匀*用5mol/LNaOH调pH为8.0I于25c下?§化46小时（2小时取样一次），测定酶活性增加的情况活化完成后，用2.5mol/LH2SO4调pH至2.53.0(收集约1.5mL,作为留样2,测蛋白含量，及时SDS化)量取体积，加入固体硫酸俊达到75%饱和度，静置过夜瓜什离心10000rpm,15min沉淀为独胰蛋白酶(2)透析将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001mol/LHCl溶液中，用2mol/LHCl调pH至3,在4c下对0.001mol/LHCl溶液透析10小时，而后改用0.01mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析过夜。I次日，离心10000rpm,15

11、min,取上清(记录样品体积，收集约1.5mL,作为留样3,测蛋白含量，及时SDS化)(2)离子交换层析法初步纯化猪胰蛋白酶用0.01mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离子交换柱*直接上样于CM-纤维素离子交换柱I以0.01mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附蛋白质用0.05mol/L,pH5.0,柠檬酸钠缓冲液洗脱，并收集，此峰为猪胰凝乳蛋白酶I待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用0.1mol/L,pH6.0,柠檬酸钠缓冲液洗脱，此时出现一洗脱峰，收集洗脱液为猪胰蛋白酶。I再生柱子(0.5MNaOH-0.5MNaOH)I用蒸储水洗至呈中性2 .蛋白质含量的测定蛋白质含量

12、测定采用紫外吸收法。用核酸蛋白分析仪分别测定蛋白质样品在280nm、260nm处的吸收值，以缓冲液为空白对照，按下式计算蛋白质质量浓度C(mg/mL)：蛋白质质量浓度=n(1.45A280-0.74A260)式中，A280：蛋白质溶液在280nm测得的吸收光度；A260：蛋白质溶液在260nm测得的吸收光度；n：稀释倍数。3 .酶活力的测定drn3支试管按i3编号。NO.1体系：样品管酶液1mL(用0.1MTris-HCl、pH8.0缓冲液稀释至合适的浓度，酶液与缓冲液的量为1mL,可根据具体情况来调节酶液的浓度，一般粗胰蛋白酶为1080vg/mL,纯化胰蛋白酶约为620gg/mL)精确加入3

13、7c预热的10mg/mL酪蛋白溶液1mL混匀，立即置于37c水浴中，准确反应10min加入8%三氯乙酸3mL迅速摇匀，终止反应3000r/min,5minU取上清，测A280NO.2体系：对照管37c预热的10mg/mL酪蛋白溶液1mL8%三氯乙酸3mL摇匀加入酶液(与体系1浓度相同)1mL37C,10min取出，终止反应3000r/min,10min取上清，测A280NO.3#系:空白管分别加入3mL8%三氯乙酸和2mL0.1MTris-HCl、pH8.0缓冲液，3000r/min,5min离心，取上清，测A280胰蛋白酶活力的计算一f,八、一,、.，、，A280胰蛋白酶活力单位数=tA28

14、0比活力二酶活力单位/毫克蛋白质=CVt式中A280样品管A280-对照管A280C每个样品管中酶液的浓度（mg/mL）V每个样品管中酶液体积（mL）t反应时间（min）4.纯化效果测定各阶段（粗酶液留样1,酸沉淀后酶液留样2,胰蛋白酶原样品留样3,胰酶激活后样品留样4,离子交换层析后活力较高样品留样5）的纯化效果用l2%的SDSPAGE分析，考马斯亮蓝R-250染色。五.实验数据的记录1.提纯过程样品体积（mL）A280A260活性NO.1A280NO.2A280粗提液（留样1）胰酶激活后（留样4）透析后上柱前品（留样5）管1略管3管5管72.离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量及活性。蛋白

15、含量(mg/mL)或A280活性(NO.1A280-NO.2A280)1357:六、结果与讨论1 .离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量及活性。2 .以管数为横坐标、以A280及活性为纵坐标，制作双坐标图的离子交换层析曲线。(以管数为横坐标、以蛋白含量及活性为纵坐标，制作双坐标图的离子交换层析曲线)3 .测定粗酶液、胰酶激活后样品、离子交换层析收集管中样品液的体积及酶活力，完成纯化表格。提取纯化步骤总酶活(U)总蛋白量(mg)比活(U/mg)收率(%)纯化倍数粗酶液胰酶激活后样品透析后上柱前样品离了交换层析4.SDS-PAGE电泳结果七、思考题1 .提取制备猪胰蛋白酶的过程中，应特别注意哪些主

16、要环节和影响因素？2、胰蛋白酶活力的测定方法还有哪些？3.在实验中，可以采取什么方法来提高产率和比活率？八、参考文献1、马丽、邱业先、杨进军等.元宝枫蛋白酶的分离纯化及其生化性质.植物资源与环境学报，2005,14(1):6-92、俞建瑛、蒋宇、王善利编.生物化学实验技术.化学工业出版社.20053、陈珊珊、林雄水、翁凌等.草鱼胰蛋白酶的分离纯化及性质研究.集美大学学报(自然科学版)，2005,10(4):300304附录:1 .硫酸镂溶液饱和度计算表（0C）,%20253035404550556065707580859095100硫酸镂初浓度%饱和度每100毫升溶液加固体硫酸镂的克数010.

17、613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.757.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.7152.65.48.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.22002.75.58.311.314.317.520.724.1

18、27.631.234.938.742.746.951.255.72502.75.68.411.514.617.921.124.528.031.735.539.543.647.852.23002.85.68.611.714.818.121.424.928.532.336.210.244.548.83502.85.78.711.815.118.421.825.429.132.936.941.045.34002.95.88.912.015.318.722.225.829.633.537.641.84502.95.99.012.315.619.022.626.330.234.238.35003.06.09.212.515.919.423.026.330.834.85503.06.19.312.716.119.723.527.331.36003.16.29.512.916.420.123.127.96503.16.39.713.216.820.524.47003.26.59.913.417.120.97503.26.610.113.717.4