淋球菌核酸检测试剂盒的质量评价-最新年文档

1、淋球菌核酸检测试剂盒的质量评价ObjectiveToevaluatetwelvePCRkitsfordetectionofNeisseriagonorrhea.MethodsTwelvekindsofNeisseriagonorrhoeaePCRkitwereselected,thetemplatesextractandnucleicacidamplificationofthequalitycontrolreferencewereconductedaccordingtothekitintroduction.Thecoincidenceratesofpositiveandnegativerefe

2、rence,thewithin-runprecisionandthelowestdetectionlimitofthekitsweredetectedaccordingthenationalreferencepanelofNeisseriagonorrheaandwerecomparativelyanalyzed.ResultsThecoincidenceratesofpositivereferenceandnegativereferenceofallkitswere100%,andtheCVoftestresultsforprecisionwasalllessthan5.0%.Thelowe

3、stdetectionlimitof10kitswas1x103bacteria/mL,and3kitswas1X102bacteria/mLamongthem.ButtheCVoftheother2kitswasonly1x104bacteria/mL.ConclusionThetwelvePCRkitsforNeisseriagonorrheaarereliable.淋球菌常可引起人类泌尿生殖系统化脓性感染,俗称淋病.淋病是我国发病率较高的性传播疾病之一,及早发现和有效治疗是限制淋球菌感染的有效方式1-2o目前用于淋球菌的检测方法很多,如涂片法、培养法、免疫学检测法3、酶法4、核酸检测法等

4、.近年来淋球菌的核酸检测以其快速、灵敏成为主流方法5-6,目前国内已有17家企业的淋球菌核酸检测试剂盒PCR荧光探针法、7家企业的淋球菌、解月尿月尿原体、沙眼衣原体二联或三联核酸检测试剂盒PCR戋光探针法获得国家食品药品监督XX局,XX局的批准,尚有多家企业申报注册.本实验使用淋病PCR式剂盒质控参考品,对8家企业已上市的9种试剂盒及20212021年3家企业在中国食品药品检定研究院以下简称“中检院中报注册的淋球菌核酸检测试剂盒PCR-荧光探针法、沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒PCR戋光探针法进行检测,并进行质量分析与评价.1对象与方法1.1 淋病PCR式剂盒质控参考品参考品由中检院呼吸道细

5、菌疫苗室制备,包括10份阳性参考品NG-P卜NG-P10、10份阴性参考品NG-N卜NG-N10、5份精密度参考品NG-及和1份最低检出限参考品NG6,共计26份,批号：210015-202111.1.2 试剂与仪器试剂盒AI为已上市销售的8家企业的9种不同的淋球菌核酸检测试剂盒PCR荧光探针法,试剂盒J、K、L为20212021年在中检院申请注册检验的来自3家企业的试剂盒,其中试剂盒K为沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒PCR茨光探针法).QIAampDNAMiniKit(NO.51304)购自QIAGE心司；7500荧光定量PCFa(ABI7500)为ABI公司产品；全自动医用PCR分析系统

6、(GeneXpertDx)为Cepheid公司产品.1.3 方法根据各试剂盒的产品说明书对参考品进行处理,提取DNA将阳性参考品、阴性参考品处理后根据各试剂盒扩增条件分别进行PCR将精密度参考品分10次提取核酸模板,分别经10次PCR扩增,计算批内Ct值的变异系数(CYo将最低检出限参考品NG-S进行10倍系列稀释3个稀释度,浓度分别为1X104、1X103、1X102个菌/mL,标记为S4、S3S2,分别提取模板进行PCR假设试剂盒中不含DN碾取试剂或者对提取试剂未作特殊说明,那么采用Qiagen公司的QIAampDNAMiniKit提取DNA根据各试剂盒的说明书,在荧光定量PCFa上进行扩

7、增.2结果2.1 阳性参考品符合率采用10份淋球菌阳性参考品对12种试剂盒的18批次样品进行检测,各试剂盒的阳性参考品符合率均为100%符合参考品的检测要求.见表1.2.2 阴性参考品符合率采用10份淋球菌阴性参考品对12种试剂盒的18批次样品进行检测,各试剂盒的阴性参考品符合率均为100%符合参考品的检测要求.见表1.2.3 批内精密度采用精密度参考品对12种试剂盒的18批次样品的批内精密度分别进行检测,具目的基因检测通道Ct值为13.2230.00,CV值为0.3%4.6%,均低于5.0%.见表1.2.4 最低检出限采用系列梯度稀释的最低检出限参考品对不同企业的试剂盒进行检测,结果发现不同

8、试剂盒的最低检出限有所不同,12种试剂盒中有10种试剂盒的最低检出限能到达1X103个菌/mL,其中试剂盒DJ、K的最低检出限可到达1X102个菌/mL.但另外2种试剂盒试剂盒I、L的最低检出限仅到达1X104个菌/mLo见表2.3讨论体外诊断试剂国家标准物质对于体外诊断试剂的质量限制尤为重要,是进行质量评价的重要物质7,本实验采用的淋病PCR式剂盒质控参考品为中检院制备的国家参考品,用于淋球菌核酸检测试剂盒的质量限制和评价.本研究对9种市售及3种正在进行申报注册检验的淋球菌相关的核酸检测试剂盒PCR荧光探针法进行检测,旨在了解我国淋球菌核酸检测试剂盒PCR-荧光探针法的质量状况.结果显示,各

9、试剂盒均能正确区分阳性参考品以及阴性参考品,符合率均到达100%用精密度参考品检测不同试剂盒的批内精密度,其目的基因检测通道的Ct值为13.2230.00,CV值为0.3%4.6%,均在5.0%以下,说明这12种试剂盒性能较稳定,重复性好.但不同试剂盒的最低检出限存在差异,12种试剂盒中的12种试剂盒中有10种试剂盒的最低检出限能到达1X103个菌/mL,其中试剂盒D、J、K的最低检出限能够到达1X102个菌/mL,灵敏度较高.但试剂盒I、L的最低检出限仅到达1X104个菌/mL.对于注册检验的试剂盒,通过对同一企业不同批次样品的检测结果进行比拟,发现各批次样品的最低检出限均符合相应的产品技术

10、要求,但各批次样品的精密度存在一定差异.淋球菌核酸检测试剂盒PCR变光探针法的原理是根据淋球菌特异性基因区域设计引物和探针,在提取样本DNA1后采用荧光PCR寸其进行检测.11家企业的12种试剂盒均采用PCRTaqman荧光探针相结合的技术,实时监测扩增产物,通过监测整个PCRS程荧光信号的变化,对未知模板进行定性分析.常作为淋球菌检测的靶基因有隐蔽性质粒基因cppB网、染色体基因、透明蛋白opa基因9、PorA假基因10-11、菌毛DNArRNA基因12等,目前国内淋球菌核酸试剂盒所采用的目的基因主要有cppB基因、opa基因、PorA假基因.cppB基因是较早应用的靶基因13,但由于cppB基因在一些淋球菌菌株中缺乏14-16,存在出现假阴性结果的风险,Bruisten等17认为cppB基因不宜作为淋球菌基因扩增的靶标.近年来,较多使用的靶基由于opa基因和PorA假基因.本实验所使用的试剂盒分别含有这3种靶基