双光子激光共聚焦显微技术研究植物-化学

1、双光子激光共聚焦显微技术研究植物-化学物质相互作用进展李青青，陈宝梁5（浙江大学环境科学系，杭州 310058） 摘要：双光子激光共聚焦显微镜是一类非线性光学显微镜，是目前应用较多的多光子显微镜 中的一种。利用物质本身的“双光子效应”或者通过特定荧光标记，双光子激光共聚焦显微 镜可以实现对样本的高分辨率活体三维扫描。本文简要介绍了双光子激光共聚焦显微镜的原10理及其在植物微细结构及植物与外源性物质相互作用中的应用研究进展。 关键词：环境化学；双光子激光共聚焦显微镜；植物；外源物质；原位观测 中图分类号：X131；X132A review on the application of two-ph

2、oton laser scanning15confocal microscope in the study of plant-chemical interactionLI Qingqing, CHEN Baoliang(Department of Environmental Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, PR China)Abstract: The two-photon laser scanning confocal microscope (TPLSCM) is a class of nonlinear20optics, whic

3、h is one of the most applied multi-photon microscope. Because the two low-energy photons simultaneously was absorbed by a molecule and excite fluorescence, the TPLSCM allows imaging of living tissue up to a very high depth, that is up to about one millimeter. By appropriate use of TPLSM, a high-reso

4、lution three-dimensional imaging of physiology, morphology and biochemical interactions in intact tissues or live plants can be achieved. This article briefly25describes the principle of the two-photon laser scanning confocal microscope and its application in study on the plant fine structure and th

5、e interactions of plant with exogenous substances.Key words:Environmental chemistry; Two-photon laser scanning confocal microscope; plant;xenobiotic chemicals; imaging in vivo and in situ.300引言显微镜技术的发展开启了人们探索微观世界的大门。随着显微镜技术的不断发展，人们 可以看到的微观结构的尺寸已经达到纳米甚至纳米以下，观察到的图像也变得丰富多彩。随 着科技的不断发展，科学研究的不断深入，传统的观测目标结

6、构的显微镜已经不能满足科学 研究的需求，当前显微技术正朝着高分辨率图像、穿透表面观测内部结构、无损伤活体观察35等方向发展。 激光共聚焦电镜的发明历史有几十年，而第一台商业化的多光子激光共聚焦显微镜至今则仅十几年，但是对于其的开发利用却十分的迅速。一个低波长光子激发产生的能量等同于两个二倍于单光子波长的高波长光子产生的能量。这个理论虽然早在上世纪三十年代便被提基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助（编号：J20091588）作者简介：李青青（1988-），女，博士研究生，主要研究方向：污染物在植物角质层上的迁移转化行为 通信联系人：陈宝梁（1973-），男，博士、教授、博士生导师，主要研

7、究方向：土壤污染控制与修复、环 境界面化学与生物有效性、环境吸附材料设计及应用. E-mail: 出1，但由于科技发展的限制以及人们对量子光学认识的不足，直到上世纪八九十年代，双40光子技术才逐渐被人们认识并加以利用。1990 年以前，Web of Science 上以“confocal microscopy”为关键词检索文献数仅 80 篇,1990 年文献数已达到 221 篇，此后，关于激光共 聚焦显微镜的文献快速的增加，2012 年文献数已达 3326 篇。1990 年 Webb WW 等人在 Science 上发表论文展示了双光子激光共聚焦显微镜的原理及应用2

8、，对双光子技术的应用和推广产 生了不可忽视的影响。该技术已经在神经生物学中得到广泛的应用3-5，成为该领域常用的45研究成像手段。这项技术基础研究不断深入、应用领域逐渐拓展。本文主要对双光子激光共 聚焦显微镜在研究植物-污染物相互作用的应用进行综述，以期深入掌握植物对有机污染物 的吸收积累及转化特征及规律。1双光子激光共聚焦显微镜的原理50所谓共聚焦，即一个点光源发出的一个光点在样品内形成的焦平面上反射，由一个针孔 接受反射光点成像。通过对一定尺寸样品上的点进行扫描汇总，即得到一定尺寸样品的图像 6。变换焦平面的位置，即可得到样品内不同深度的图像。激光是产生于严格平行相干光束 的单色亮光，因此

9、可以作为共聚焦显微镜的良好光源7。双光子激光共聚焦显微镜是利用激光发射出两个相同波长的光子，共同聚集在同一个点55上，从而激发出激光8。低波长的单光子产生的能量可以由两个二倍于单光子波长的光子实 现，例如一个 488 nm 的单光子可以激发使荧光蛋白染料产生在波长为 530 nm 荧光，而将光 源换做两个 976 nm 的光子同时聚焦，同样可以在 530 nm 出激发出激光9。这样大大降低了 激发光的能量，一方面降低了对样品的光损伤，另一方面扩展了激发光的波长范围。在双光子激光共聚焦显微镜中，共聚焦是由两个光子共轭形成的，不需要针孔。602双光子激光共聚焦显微镜在植物-化学物质相互作用中的应用

10、研究进展双光子激光共聚焦显微镜应用于植物的研究相对较少，目前主要以研究叶绿素等植物荧 光物质的分布及相关生化过程如光合作用及其机制；植物自体物质如淀粉的分布；离子，如 Na+、Ca2+等对植物的胁迫作用；利用植物蛋白、氨基酸及基因的特异荧光标记追踪；根际65微生物在根部内外的分布、作用过程；植物生命过程；环境污染物等在植物体内的分布及传输等。 利用植物本身的荧光效应的样品观察叶绿素是植物体内常见的荧光物质，由于其在光合作用中的重要作用而被科学工作者广 泛研究。通过对叶绿素荧光寿命的定量探测10，可以对光合作用过程进行一定的阐释。胡70萝卜素、叶黄素等植物色素都可以在一定波长激光的激发下产生荧光

11、11,12。 淀粉是植物体内一类重要的多糖，淀粉颗粒中的晶片尺寸约为 910×10 nm13，由支链淀粉双螺旋结构及其之间交错分布的分支区域组成，具有高度双折射的特性14。这样有序7580859095100105的纳米层状结构可以被称作生物光子，能够打破中心对称并产生强烈的二次谐波，从而可以在激光共聚焦显微镜下观察13。图 1 西红柿角质层的 3D 构形15（a, b）两个不同角度旋转后的角质层亚显微结构; (c-e) 一个表皮细胞上的角质层：IST 内表面地势，ECL外角质层, ICL 内角质层, AP 角质钉, ACC 背斜角质通道, ASG 附着小球体, DSG 分离小球体,

12、N 细胞核Figure 1. 3D opaque models of the tomato cuticle, generated by the VOLOCITY program.(a,b) Cuticle ultrastructure from two angles of rotation. (ce) Close view of the cuticle surrounding a single epidermal cell. The internal surface topography (IST) of lipophilic material is indicated by circles.

13、 In (d) and (e), arrowheads indicate threads of low-intensity fluorescence penetrating radially through the inner cuticular layer (ICL). (f) Close view showing a region with attached sub-epidermal globules (ASG). ACC, anticlinal cuticular channel; AP, anticlinal peg; ASG, attached subepidermal globu

14、le; DSG, detached sub-epidermal globule; ECL, external cuticular layer; ICL, inner cuticular layer; N, nucleus.2.2 利用荧光染料标记的植物样品观察2.2.1植物样品三维结构 一般情况下，具有双光子效应的自然物质是非常少的，要想实现对样品 3D 构形的描绘，通常都是采用对样品中分布最广泛的组分进行染色，图层叠加构建三维图形；或者利用不同 的荧光染料对样品不同组分进行染色，利用各荧光染料的特异荧光激发波长得到不同通道的 图像在进行不同通道图像的叠加构建三维图形，这样不仅可以得到较为完善

15、的样品三维结构，同时还能够得到样品中不同组分的分布情况。图 1 中所示为西红柿角质层的 3D 结构15。110115120图 2 Na+在水稻细胞中的分布16Vac 液泡 Cyt 细胞质Figure 2. Sodium-binding benzofuran isophthalate (SBFI) fluorescence in rice cells.Subcellular localization of SBFI in Jaya cells as seen by two-photon, differential interference contrast(DIC)-section using

16、an excitation of 730 nm.125130135140145图 3 Fluo-4/AM 荧光标记的木槿花瓣细胞的双光子图像17A：自体荧光；B：细胞间钙信号；C：A 和 B 信号混合；D, E：另两处 Ca-3 信号混合；F：Ca-0 信号混合Figure 3. Multi-photon images with 8 M Fluo-4/AM in calcium-treated H. syriacus Parangsae petal cell at full opening (Ca-3, Stage -1，A-E) and calcium-untreated petal cel

17、ls at full opening (Ca-0, Stage -1，F).A: Autofluorescence. B: Intracellular calcium signal. C: Merged image of A and B. D, E: other merged image of Ca-3 (Stage -1) petal cells. F: Merged image of Ca-0 (Stage -1) petal cells.×1002.2.2植物生物、生理过程研究 植物耐盐胁迫研究是植物生物生理学的重要部分，Na+参与了植物体内很多生物化学过程。Na+特异荧光染料

18、 SBFI 对其进行标记（图 2）16，可以追踪其在植物内的分布和转运， 作为检测植物体内生理过程的重要指标和植物耐盐性研究的有效手段。与植物抗旱性相关的 Ca2+可以用与之特异结合的荧光染料 fluo-4 进行标记（图 3）17。 谷胱甘肽存在于几乎身 体的每一个细胞，能帮助保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。利150155160165170175180用谷胱甘肽特异荧光染料 MSB 可以定量谷胱甘肽在细胞中的含量水平18。利用 NAPI 对DNA 的特异荧光，可以观察到活体花粉囊中的减数分裂过程，在不破坏样本的情况下直观 观察植物生命过程19。2.3 植物体中环境污染物

19、分布观测K. C. Jones 等人利用双光子激光共聚焦手段对外源化合物在植物体内的可视化分布特 征及作用机制做了大量工作20-26，主要的化合物为典型的持久性有机污染物 PAHs(多环芳烃) 和近年来备受关注的纳米颗粒。利用化合物自身的双光子效应，首次在植物体内观测到了环 境污染物的分布并对其随时间的传输过程进行了跟踪及机理研究，绘制了 PAH 穿透植物角 质层进入植物体的两种模型（图 4）23；提出纳米颗粒在植物体内的团聚现象，以及纳米颗 粒对有机污染物的摄取增强作用（图 5）26。Hg2+和甲基汞能够增强叶绿素的荧光寿命，改 变细胞结构。通过定量测定 Hg2+和甲基汞暴露下的叶绿素荧光寿

20、命以及利用细胞计数，可 以研究 Hg 对植物细胞的影响和毒性27。Al 进入植物体后会与植物组织结合改变细胞原有 性质而产生毒害，许多研究证明铝会产生阻碍植物根细胞壁的离子交换，抑制根尖分生组织 的细胞分裂，影响植物矿质元素和营养成分的吸收和代谢，影响酶的活性等多方面的毒害效 应。因此深入了解铝在植物体内的作用过程、机制对铝毒的研究和缓解有着重要的作用。铝 的荧光染料有多种，常用的有荧光镓试剂（图 6）28。图 4 菠菜和枫叶在菲暴露 12 天后角质层和细胞上菲的分布23Figure 4. Schematic diagrams showing the locations where phena

21、nthrene was visualized within leaves of spinach (left) and maize (right) after 12 days exposure to an atmosphere contaminated with phenanthrene. Greater detail of the apoplastic and symplastic flow is shown in (b).185190195200205210215220图 5 菲和多壁纳米碳管在小麦根细胞上的分布261 根表皮，2 根皮层细胞，3 多壁纳米碳管，4 菲Figure 5. Sc

22、hematic diagram showing the fate and behavior of MWCNTs at the wheat root surface. MWCNTs are shown in red at the root surface, piercing the epidermal cell wall and entering the cellular cytoplasm. Phenanthrene is also shown at the root surface, interacting with MWCNT and entering cells pierced by M

23、WCNTs图 6 荧光染料对植物根的染色28A DIC 图像，B 荧光镓试剂染色的 Al 的分布，C DAPI 染色的分生细胞分布Figure 6. Cross-sections from roots of cv Young exposed to 2.9 M Al3+ for 72 h.Lumogallion-Al and DAPI fluorescence in cells 500 m back from the root tip. Bar = 10 m.2252302353展望双光子激光共聚焦显微技术是研究植物体生化过程、植物与外源物质相互作用机制及外 源物质在植物体内的传输代谢行为研究中

24、具有不可替代的作用。随着对仪器材料、技术、算 法等的不断创新，目前的扫描深度已经达到 1 mm，扫描精度也日益提高，波长范围更加广 泛，可用的化合物不断被发现和更新。通过对同一样品在一定时间内不同时间点上的目标物 质荧光响应可以得到耦合时间的四维精细结构。然而在对于研究植物和外源物质的相互作用机制，环境中的化合物在植物体内的迁移转化及归趋行为的研究中，TPLSCM 仍然是一项 应用较少的技术。同时，由于环境样品的复杂性，会给荧光探测灵敏的 TPLSM 检测带来干 扰，如污水处理中所用污泥中微生物的活性研究中，由于高能激光的激发，污泥中一些表面 活性剂、塑料、荧光增白剂等会对检测微生物的荧光产生

25、很大的干扰。该项技术在环境化学 领域的研究才刚刚起步，具有双光子效应的环境化合物的发现，对特定化合物的特异标记荧光的开发，干扰因素的排除等问题都有待解决。参考文献 (References)2402452502552602652702751 Sheppard C J R, Kompfner R. Resonant scanning optical microscope J. Applied Optics, 1978, 17(18):2879-2882.2 Denk W, Strickler J H, Webb W W. Two-photon laser scanning fluorescence

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