微生物的分离、纯化、培养与初步生化鉴定

1、WORD格式微生物的别离、纯化、培养与初步生化鉴定9 级生命科学与技术基地班摘要专业资料整理WORD格式此次实验主要是对微生物进展别离，纯化，培养与初步生化鉴定。通过实验了解培养基的配制及干湿灭菌的原理、方法。用简单单细胞挑取法和平板别离法别离纯化微生物，其进展形态特征的观察并掌握平板菌落计数法的原理和方法。了解不同微生物对各种有机大分子的水解能力，不同微生物有不同的酶系统，掌握大分子实验在微生物鉴别中的作用，握糖发酵、 IMVIC 的原理、方法和在肠道细菌鉴定中的作用。对掌专业资料整理WORD格式关键词培养基灭菌别离与纯化鉴定IMVIC前言培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的

2、营养物质，用以培养、别离、 鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。不同微生物选用不同培养基，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而到达灭菌的目的。微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进展别离。别离纯化方法很多，根本原理相似，即将待别离样品进展一定的稀释，并使微生物的细胞或孢子尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落，常用方法有简单单细胞挑取法，平板别离法。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通

3、过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。接种的关键是要严格的进展无菌操作。微生物的培养特征是指微生物在固体培养基、半固体和液体培养基中生长后所表现的群体形态特征。不同的微生物具有不同的培养特征，固体培养基又分为平板和斜面两种。不同来源的样品接种于平板培养基上，在适宜温度下培养，1-2d 内会形成菌落。每一种细菌所形成的菌落有它自己的特点，如菌落的大小， 外表枯燥或湿润、隆起或扁平、 粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或严密等。可通过平板培养来检测不同的材料中微生物的数量和类型。平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后接种到平板上，经过培养， 由每个单细胞生长繁殖

4、形成肉眼可见的菌落，一个菌落应代表原样品中的一个单细胞，统计菌落数， 根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统，有些细菌能分泌脂肪酶，有些细菌能分泌淀粉酶。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸如乳酸、醋酸、丙酸等和气体如氢、甲烷、二氧化碳等；有些细菌只产酸不产气。因此糖发酵在肠道细菌的鉴定上有重要作用

5、。酸的产生可专业资料整理WORD格式利用指示剂来断定，气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。某些细菌如大肠杆菌、志贺氏菌、产气杆菌等分解葡萄糖产生多种有机酸，导致培养基 PH 值下降。 可用甲基红作为指示剂， 中性红色， 酸性黄色。 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合， 就会形成红色的玫瑰吲哚。 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇， 后者在强碱环境下， 被空气中氧气氧化为二乙酰， 二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称 V.P.+反响。材料与方法1 培养基配制1.1 药品：

6、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、可溶性淀粉、 K2HPO4、KH2PO4、 蒸馏水、琼脂、 1mol 氢氧化钠、花生油、葡萄糖、溴甲酚紫、中性红、乙醇1.2 器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、PH 试纸、试管、三角瓶、移液管、牛皮纸、棉花、线绳、高压锅。1.3 培养基的制备过程称量 - 溶解加水，加热，搅拌- 调节 pH 值 NaOH- 过滤 ( 土豆培养基 )- 分装及包扎- 灭菌高压蒸汽灭菌，含葡萄糖和乳糖的培养基在115灭菌，其它121灭菌所需培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基100ml马铃薯培养基 200ml油脂培养基100ml淀粉培养基 100ml伊红美兰培养基 100ml 蛋白胨水培养基 1

7、00ml 糖发酵培养基 100ml 葡萄糖蛋白胨水培养基250ml 三倍浓缩的乳糖发酵培养基350ml 普通浓度乳糖发酵培养基 150ml第二组配制：牛肉膏蛋白胨培养基100ml马铃薯培养基200ml 伊红美兰培养基100ml 葡萄糖蛋白胨水培养基250ml 普通浓度乳糖发酵培养基150ml 2 微生物别离纯化1.1 材料：牛肉膏蛋白胨培养基、土豆培养基、油脂培养基、淀粉培养基1.2 仪器：移液管、无菌水、接种环、酒精灯、土壤悬液、无菌培养皿、涂棒、恒温培养箱等。1.3 内容及方法：1.3.1.采集土样，制备土壤悬液：1g 土稀释到 10-5，称取5 克土样放入装有45ml无菌水和玻璃珠的三角

8、瓶中，连续摇动30 分钟，依次稀释至 10-51.3.2 倒平板：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近翻开一缝，迅速倒人培养基约25ml，加盖后轻轻摇动使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板1.3.3 涂布别离：将0.2m 菌悬液小心的滴在平板培养基外表位置，右手拿无菌涂棒将菌悬液沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀1.3.4 恒温培养箱培养： 土豆培养基板于25 倒置培养 24h，牛肉膏蛋白胨培养基、油脂培养基、淀粉培养基于30 倒置培养 24h后观察1.3.5 观察并记录菌落形态1.3.6 计算同一稀释度

9、三个平板上的菌落平均数：每毫升中菌落形成单位cfu =同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数53 大分子物质水解试验3.1 材料：土壤别离菌油脂培养基淀粉培养基 接种环 鲁戈氏碘液3.2 方法与步骤：专业资料整理WORD格式3.2.1油脂水解试验： 在油脂培养基中接种土壤别离菌，37 度培养 24h,取出油脂平板，观察平板外表长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反响。3.2.2淀粉水解试验：在淀粉培养基上接种土壤别离菌，37 度培养 24h，取出淀粉平板，翻开皿盖，加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈， 说明淀粉已被水解， 为阳

10、性。 透明圈的大小可初步判断该菌水解能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的上下。4 糖发酵试验4.1菌株：大肠杆菌 枯草杆菌 土壤别离菌4.1材料：盛有葡萄糖发酵培养基的试管内置德氏小管试管架接种环4.3步骤：取葡萄糖发酵培养基的试管4 支，分别接种大肠杆菌，枯草杆菌。自制菌，阴性对照；于37 度培养 24h.5 吲哚、甲基红、伏普试验5.1 菌株：大肠杆菌产气杆菌土壤别离菌5.2 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基5.3 试剂：甲基红试剂吲哚试剂伏普试剂5.4 器材：接种环酒精灯恒温培养箱5.5 步骤：5.5.1 甲基红试验：于葡萄糖蛋白胨培养液中，各参加2 3 滴甲基红指示剂，注意沿管

11、壁参加，仔细观察培养液上层，假设培养液上层变成红色，即为阳性反响；假设仍呈黄色，那么为阴性反响，分别用“或“表示。5.5.2 吲哚试验：取蛋白胨水培养物，参加40 滴乙醚，摇动数次，静置5-10 分钟，待乙醚上升后，沿管壁徐徐参加5 滴吲哚试剂对二甲基氨基苯甲醛，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反响，记录为吲哚试验阳性结果用“表示； 假设无红色环状物出现者记录为吲哚试验阴性结果用“表示。5.5.3 伏普试验： 取葡萄糖蛋白胨水培养物，参加等量20 滴V.P. 试剂40% 的 KOH和 5%的 -萘酚，摇匀，以使空气中的氧溶入，静置于37恒温箱中保温30min 后，假设培养液呈红色，记录为

12、 V.P. 试验阳性结果用“表示 ； 假设不呈红色，仍未为黄中带蓝色者记录为 V.P.试验阴性结果用“表示。结果记录1 微生物的培养特征观察牛肉膏蛋白胨培养基土壤菌悬液 ：乳白色，圆形或近圆形，边缘光滑，菌落较分散，大小不一，但大菌落较多；土豆培养基土壤菌悬液 ：乳白色，圆形，边缘光滑，菌落密集，数目较多，菌落多比较小；油脂培养基：菌落淡粉色，圆润，边缘整齐光滑，菌落密集，分布均匀，大小相差不大；土豆培养基空气微生物 ：菌落密集，分布不均，大局部有菌毛，不同颜色，褐色、白色、绿色，大小不一。专业资料整理WORD格式2平板计数法计数微生物牛肉膏蛋白胨培养基：1号 42 个，2 号 69个1ml

13、菌悬浮液形成菌落单位= 42+69 /2*105*5=2.775*107cfu土豆培养基：1号 58 个,2 号 76个专业资料整理WORD格式1ml 悬浮液形成的菌落： 58+76 /2*105*5=3.35*107cfu3 生化鉴定（ 1大分子物质水解实验“ +表示阳性； “-表示阴性专业资料整理WORD格式菌名土壤别离液油脂水解实验+(出现红色淀粉水解实验+无色透明专业资料整理WORD格式分析：选取的土样中含有可分解淀粉的菌，在菌苔周围出现无色透明圈，但透明圈不是很明显， 说明这些菌产生胞外淀粉酶的活性不是很高； 油脂水解试验出现红色斑点说明土壤中含有分解油脂的菌。 2糖发酵实验专业资料整理WORD格式产酸产气：+产酸不产气：+不产酸不产气：专业资料整理WORD格式菌名现象大肠杆菌+枯草杆菌+土