噬菌体的分离与纯化(整理优化版)

1、噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1 .菌种：大肠杆菌2 .试剂：氯仿3 .培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白月东2g,牛肉膏0.6g,NaCl1g,力口H2O至200mL,pH7.4,121C20min高压灭菌；2） 3叶肉膏培养液：胰蛋白陈3g,牛肉膏0.9g,NaCl1.5g,力口H2O至100mL,pH7.4,121C20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121c20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121C20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌

2、细菌过滤器（孔径0.22um）,培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1 .噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白腺培养液”的试管中，混合均匀后置37c培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。(2)增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白月东液体培养基2)大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL,混合后置37c振荡培养1224h。(3)制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。(4)确证试验所得裂解

3、液经37c培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。(5)噬菌体检测：在牛肉膏蛋白月东琼脂平板上加入0.1mL(1滴)大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37c培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。2 .噬菌体的纯化(1)取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；(2)取上层琼脂培养基溶化并冷却至45C(可预先溶化后置4555c水浴锅内保温备用)，加入0.2mL上

4、述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37C培养1224h;(3)取由培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征(如噬菌斑形状、大小、清亮程度等)。此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体，需进一步纯化；(4)纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，麻取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37c振荡培养，直至试管甲菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清液，再重复步骤、直到由现的噬菌斑形态一致为止注意事项1 .使用仪器要保证是灭菌的；2 .注意琼脂的浓度；3 .氯仿是易燃品，应远离火焰一、生物测定法1、双层琼脂平板法1）倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿

5、）待用。2）倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50c左右时，每管中加入大肠杆菌菌液0.2mL,上述噬菌体增殖液0.20.5mL,混合后立即倒入上层平板铺平。3）恒温培养30C恒温培养612h观察结果。4）观察结果如有噬菌体，则在双层培养基的上层由现透亮无菌圆形空斑一噬菌斑。2、单层琼脂平板法省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%融化后冷却至45c左右，如同上法加入大肠杆菌和噬菌体增殖液，混合后迅速倒平板。30c恒温培养616h后观察结果。噬菌体效价的测定1、倒平板将融化后冷却到45C左右的下层肉膏蛋白月东固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放

6、，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。2、稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白陈水的试管中，即稀释到10、依次稀释到10-6稀释度。噬菌体与菌液混合将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37c水浴中保温5min,让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。接种上层平板将11支融化并保温于45C的上层肉膏

7、蛋白腺半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37c培养。观察并计数观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。计算公式：N=Y/VXX（N:效价值，Y:平均噬菌斑数/皿，V:取样量，X:稀释度）例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：N=186/0.1X10-6=1.86X109。结果1、噬菌体检查2）绘由平板上的噬菌斑检测结果，指由噬菌斑和宿主细菌。2、噬菌体效价测定1）平板上噬菌斑数目噬菌体稀释度10-410-510-