大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定

1、大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定         11-01-09 11:15:00     编辑：studa20          作者：任吴超，李冬民，王 璇，高 玉，韩 燕， 宁启兰，张富军，宋天保，吕社民【摘要】  目的 建立大鼠肝脏干细胞的Pdx1基因表达系。方法 逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉，经胶原酶消化并分离肝脏干细胞；免疫组织化学鉴定

2、大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达；构建pEGFPPdx1表达载体并酶切鉴定，用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后，荧光显微镜观察GFP表达，免疫组织化学鉴定Pdx1的表达。结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性；pEGFPPdx1表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx1蛋白。结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx1表达系。 【关键词】  大鼠；肝脏干细胞；胰腺十二指肠同源盒；表达载体    ABSTRACT: Objective 

3、 To establish a liver stem cell line expressing pancreatic duodenal homeobox (Pdx1) in rats. Methods  Rat liver stem cells were obtained by digestion of collagenase IV and isolation after hepatic portal vein puncture. The liver stem cells were identified by using specific antibodies against cyt

4、okeratin 18 and 19 and AFP. The stem cells were transfected with pEGFPPdx1 expressing vector using liposome 2000, and Pdx1 exprssion was identified by observing green fluorescence protein expression under the microscope and by using immunohistological staining. Results  Rat liver stem cells iso

5、lated and cultured through hepatic portal vein puncture were capable of mitosis and proliferation, and could also express cytokeratin 18 and 19 and AFP, suggesting that they are indeed liver stem cells. Pdx1 gene transfected cells can express green fluorescent protein reporter gene and Pdx1 protein.

6、 Conclusion  A Pdx1 expressed rat liver stem cell line has been successfully established.    KEY WORDS: rat; liver stem cell; pancreatic duodenal homeobox (Pdx1); expression vector  1型糖尿病是严重危害人类健康的代谢性疾病。建立内源性胰岛分泌系统,包括胰腺移植、胰岛移植等对于1型糖尿患者来说是重要的治疗手段。但是，伦理和免疫排异反应使其应用受到限制。近年来，人工诱导

7、干细胞向能够分泌胰岛素的细胞进行分化，为胰岛移植提供了全新的细胞来源1。肝脏和胰腺来自胚胎内胚层的同一个细胞群，进化上具有相似性。肝脏干细胞可能具有在一定条件下转化为具有胰岛特征的胰岛素分泌细胞的能力2。    胰十二指肠同源盒(pancreatic duodenal homeobox, Pdx1)蛋白是胰岛内分泌细胞群发育、分化与成熟的主要调控蛋白3。小鼠体内的Pdx1基因的沉默和敲除可致胰腺发生缺失45。    已经有研究证明Pdx1在成体干细胞中的异位表达可实现成体干细胞向胰腺细胞的分化。但是，对于肝脏干细胞的研究尚无详实报道。

8、我们成功从大鼠乳鼠肝脏中分离出肝脏干细胞，并且用从胰腺中分离出的Pdx1基因成功转染这种细胞，为研究肝脏干细胞向胰岛样细胞的体外定向分化奠定了实验基础。    1  材料与方法    1.1  实验动物  出生后13d的SD大鼠新生乳鼠，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。    1.2  仪器与主要试剂  蛋白核酸定量仪型号为CE231，购于GENEGUEST；荧光倒置显微镜购于OLYMPUS，凝胶成像系统购于SYNGENE；PCR热循环仪(PTC10

9、0 BIORAD)抗大鼠CK18抗体、抗大鼠CK19抗体、抗大鼠Pdx1抗体、抗大鼠AFP抗体购于Chemicon公司；Trizol及Lipofactamine 2000购于Invitrogen公司；胎牛血清 及DMEM培养基购于Hyclone公司；型胶原酶购于Sigma公司；抗兔Cy3二抗免疫荧光试剂盒，抗小鼠FITC二抗免疫荧光试剂盒购于北京中杉公司；引物由Augct Biotechnology公司合成。    1.3  真核表达载体pEGFPPdx1的酶切鉴定  用PrimerPrimier 5.0设计Pdx1基因的引物，序列是：上游引物

10、5CCCAAGCTTATGAATAGTGAGGAGCAGTACTACG3，下游引物5CCGGATCCTCATCACCGGGGTTCCTGC3。利用TRIzol提取胰岛总RNA，RTPCR法扩增目的基因Pdx1，用限制性内切酶BamH和Hind分别双酶切Pdx1和真核表达载体pEGFPN1，凝胶回收试剂盒纯化酶切片断，T4DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5。挑选阳性克隆，质粒小量制备试剂盒提取质粒，用BamH和Hind双酶切鉴定重组载体，并对克隆的目的片段送奥科公司测序。    1.4  大鼠肝脏干细胞分离鉴定   

11、1.5  Pdx1基因转染大鼠肝脏干细胞  转染前一天消化细胞，1100r/min离心10min，1mL培养基重悬细胞，用血细胞计数板计数细胞，约6×105细胞培养到6孔板内，此日细胞达到约80%交汇。更换培养基，每孔加入2mL新鲜含血清和抗生素的培养基。在一洁净无菌离心管内依次加入4L Lipofecter、2.0g DNA，加入不含抗生素和glutamine的DMEM溶液，终体积为70L，轻轻吹打混匀。1525孵育15min把70L LipofecterDNA混合物分别加入六孔板的各孔内，轻轻混匀。细胞培养箱内培养6h后，吸除含有LipofecterDNA的培养液。每孔加入2mL新鲜细胞培养基继续培养。    1.6  Pdx1基因表达的检测  取出有细胞爬片的细胞培养皿，移液器