覃汉兵硕士学位报送图书馆版

1、分 类 号 学号 M200971420学校代码10487密级 乏氧鼠脑氧化还原状态的低温成像初步研究学位申请人： 覃汉兵学科专业： 生物化学与指导教师： 张智红 教授生物学答辩日期： 2012 年 1 月 19 日A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirementsfor the Degree of Master of SciencePreliminary Study on Redox State of HypoxicMouse Brain by Cryo-ImagingCandidate:Qin Hanbing

2、Major:Biochemistry andMolecular BiologySupervisor:Prof. Zhang ZhihongHuazhong University of Science & TechnologyWuhan, Hubei 430074, P. R. ChinaJanuary, 2012独创性本人所呈交的是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明的内容外，本不包含任何其他个人或集体已经或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全本的法律结果由本人承担。作者签名：日期：年月日使用书本作

3、者完全了解学校有关保留、使用的规定，即：学校保留并向有关部门或机构送交的复印件和，被查阅和借阅。本人华技大学可以将本的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等保存和汇编本。，在年后适用本书。本属于不。（请在以上方框内打“”）作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华技 大 学摘要*脑组织氧化还原代谢反应的正常进行，是维持脑组织结构完整和功能正常的前提。脑组织氧化还原代谢状态的正常维持需要持续有效的氧气供应，空气氧分压的细微变化都可能导致脑组织氧化还原状态的改变，即引起脑细胞线粒体中的 NADH 和 Fp 两种内源性辅酶的浓度发生改变。本文将内源性荧光成像技术和组

4、织氧化还原代谢状态低温速冻、维持技术相结合，利用多通道低温断层荧光显微成像技术获取了小鼠全脑在乏氧后的氧化还原代谢状态的多截面分布信息，这将有助于人们进一步加深认识不同生理病理状况下，脑组织的氧化还原代谢情况与其内源性辅酶的关系，为脑氧化还原代谢异常的特异性诊断、治疗以及治疗后效应的评价提供了方法。本文主要的工作包括：1、比较了断首液氮速冻法、直接整鼠液氮速冻法和漏斗式液氮速冻法三种常见固定实验鼠脑氧化还原代谢状态的方法，并根据样品结构固定完整程度、样品氧化还原代谢状态的均一性，确定了漏斗法作为适宜本研究的样品技术。2、液氮低温环境可以有效维持生物组织样品的氧化还原代谢状态不变，本文依据液氮低

5、温技术的基本原理，构建液氮低温环境，并自行设计和制作了相应的模块， 确保样品始终浸润在液氮环境中以便在样品铣削以及成像过程中维持组织样品氧化 还原代谢状态不变。3、在液氮低温环境下，采用了多通道低温三维荧光成像系统获取了小鼠乏氧和正常生理状态下 NADH 和 Fp 两种辅酶浓度的分布信息，结果发现乏氧鼠脑呈现整体高还原性，并且乏氧鼠脑的白质与灰质之间的区域差异性与正常鼠脑两种组织间的区域差异性刚好相反。：氧化还原状态 液氮低温环境 内源性荧光乏氧鼠脑 低温成像技术本课题受到自然科学基金（30801482）光电基金（2009，张智红）和 111 计划（B07038）*的资助。I华技 大 学Abs

6、tract*That, the brain tissue redox metabolic continues well, is the premise to maintain normal brain structure and function. It needs continuous and effective blood supply to keep the balance of brain tissue metabolic redox status, because even a subtle change of blood flow or blood oxygen may lead

7、to dramatic change of the metabolic redox status, which results in the concentration change of NADH and Fp in the brain cells' mitochondria. In this thesis, we have combined the endogenous fluorescent molecular imaging techniques with the low-temperature fixation technology of tissue energy meta

8、bolic status, and access to the information of the multi-sectional distribution of the whole Kunming mouse brain metabolic redox status under hypoxia. The research would be helpful for raising awareness of the relationship between the brain energy metabolism under different physiological and patholo

9、gical conditions and the endogenous coenzyme, and supplying methods for the brain metabolic abnormal specific diagnosis, treatment and following steps.This thesis includes:1. Three common fixation methods, decapitation freezing method, direct freezing method and funnel freezing method, were compared

10、. At last, we decided to choose the funnel freezing method according to the fixed complete degree of the sample structure and the sample status homogeneity.2. According to the relationship between rate and temperature the of biochemical reactions inside the body, we knew that to ensure a stable fixa

11、tion metabolic state, we must keep them in liquid nitrogen. Therefore, this thesis explored the low temperature maintenance technology using self-designed corresponding modules to keep the sample in liquid nitrogen condition.3. We used the multi-channel three-dimensional fluorescence imaging system

12、to acquire the mouse brains NADH and Fp coenzyme concentration distribution informationof death and different physiological conditions under the environment of low temperaturesThis work is supported by National Natural Science Foundation of China (No. 30801482)、Director Fund of Wuhan*National Labora

13、tory for Optoelectronics（2009, Z.H. ZHANG）、111 Project of China (B07038).II华技 大 学in liquid nitrogen. Moreover, we found that the hypoxic mouse brain was in overall high oxygen reduction; and the regional difference between brain white matter and gray matterof the hypoxic and normal brains was just t

14、he opposite.Keywords:redox state, low temperature environment of liquid nitrogen,intrinsicfluorescent molecular，hypoxic mouse brain, cryo-imagingIII华技 大 学目 录摘 要IAbstractII1绪论1脑组织氧化还原代谢反应过程概述1脑组织氧化还原状态检测技术概述21.11.21.31.41.5测氧化还原状态的荧光成像技术3大样品低温速冻技术概述8本课题的主要研究内容102鼠脑样品的低温方法132.12.22.32.42.52.6引言13固定组织氧

15、化还原状态的低温技术13三种低温样品方法16结果与分析20讨论24小结253低温成像环境的维持方法263.13.23.33.43.5引言26低温环境构建的条件和方法26低温环境组成的三大模块29结果与分析39小结414乏氧鼠脑氧化还原状态的低温成像424.14.24.34.44.5引言42材料与方法43结果与分析49讨论55小结575总结与展望585.1总结585.2展望59谢60致IV华技 大 学参考文献61录66附V华技 大 学1绪论1.1 脑组织氧化还原代谢反应过程概述脑组织细胞生命活动所需要的直接能量来源是 ATP 的高能磷酸键断裂时所的能量，而脑组织内的 ATP 则主要是在葡萄糖逐步

16、氧化分解成和水的过程中生成的1。组织消耗的葡萄糖多来自溶解在血液中的葡萄糖（即血糖 Blood Sugar，Glu），其浓度水平稳定，在一类被称作葡萄糖转运体 GLUT 的小蛋白质的作用下进入组织细胞，开始其为生命活动供能的糖的氧化还原代谢过程2。糖氧化还原代谢主要分为无氧的糖酵解（ Glycolysis ）和有氧的氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）两个过程，其物理化学本质就是电子转移过程。获得电子的反应即为还原反应，失去电子的反应称为氧化反应，且氧化反应和还原反应是不可 的。糖的氧化还原代谢过程如下1,3：葡萄糖在细胞质基质中经糖酵解途径（Glycolytic

17、Pathway）分解成酸（PyruvicAcid）部分能量酸粒体（Mitochondrion）基质中经氧化脱羧（OxidativeDecarboxylation）反应变成乙酰辅酶 A（Acetyl Coenzyme A），部分能量。乙酰辅酶A粒体基质中经三Tricarboxylic Acid Cycle）及氧化磷酸化（OxidativePhosphorylation）生成和水，大量能量。这些氧化脱氢过程所产生的烟碱腺嘌呤核苷酸NADH 和还原性氢H+和黄素蛋白FADH2 等还原当量可将其还原性氢传递给电子呼吸链来产生 ATP，供生命活动所需1,3。葡萄糖的氧化还原过程的总的方程式如式（1-1）

18、所示。葡萄糖+38ADP+38Pi+6O238ATP+44H2O+6CO2（1-1）在这个氧化还原过程中，NAD+和 FAD 这两个氧化型辅酶捕获还原性氢变成NADH 和FADH2 这些还原当量，还原当量粒体内膜上的 NADH 脱氢酶的作用下，还原性氢、电子与氧气结合生成水，能量则以高能磷酸键的形式并存在 ATP 中，而氧化后的 NAD+和 FAD 等辅酶则再次进入呼吸链进行循环1,2,3。1华技 大 学1.2 脑组织氧化还原状态检测技术概述对于氧化还原状态的研究已经了数个世纪，从早期对于动物整体氧化还原代谢的研究一直到现物化学中对于单个氧化还原代谢反应机制的探索。代谢（Metabolism）

19、的概念的出现最早可追溯到 13 世纪。当时人们虽然已经开始认识到代谢的存在，但是没有真正揭示氧化还原代谢进程的机制，人们只是普遍认为存在一种“活力”可以活化 4,5。直到 19 世纪，科学家 Louis Pasteur（路易斯·巴斯德，法国）通过对糖被酵母酵解为 的这种现象的研究才发现“酵素”6。20 世纪初，EduardBuchner（爱德华·比希纳，德国）将这种“酵素”称为酶7。这些发现与科学家 FriedrichWöhler（弗里德里希·维勒，德国）在 1828 年的关于尿素的化学共同证明了细胞中发现的化学反应和有机物与其他化学相同，都遵循化学的基

20、本原则8。虽然人们已经在很早的时候就认识到脑的重要性，但是由于技术的限制和脑组织代谢状态本身的复杂性，使得对于脑组织的氧化还原代谢状态的研究起步较晚。先前的研究主要是停留在离体脑组织的生物化学方面的研究。随着诸如色谱分析、核磁共振、电子显微学、同位素标记、质谱分析等大量新技术的应用，使得研究者可以发现并具体分析细胞中与代谢途径相关的。放射自显影技术（Radio Autography）可以显示神经细胞氧化还原代谢变化。通过显示神经细胞的氧化还原代谢水平的相对变化可以展示神经细胞在特定信息传递活动中的作用。放射自显影优点：精确、灵敏度高、分辨率好、能保存相当长时间；操作简便、无需复杂设备；可供定量

21、研究和双同位素示踪；将形态和氧化还原代谢的研究统一起来；研究某些大 在体内的动态变化过程9,10。正电子发射成像（Position Emission Tomography, PET）使用人工引入的放射性氧化还原代谢物质。这种放射性氧化还原代谢物质被注射入 。PET 设备检测氧化还原物质在脑内衰变时产生的正电子，来产生脑氧化还原图像。常用的放射性标注物质是含氟-18 的氯代脱氧葡萄糖11,12。功能性核磁共振成像技术（Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI）是一种利用血氧水平依赖性（Blood Oxygenation Level Dependent，

22、BOLD）对比结果来测量动物血氧和血流的方法。fMRI 技术通过探测反映神经组织活动的脑血流量（Cerebral Blood Flow，CBF）以及血氧的变化，间接可以反应脑组织氧化还原代谢状态。BOLD 响应比较复杂，fMRI 信号形状变化较大等因素对后续实验数据的分析2华技 大 学12,13 。和处理带来了额外的 磁共振波谱技术 (Magnetic ResonanceSpectroscopy Technology, MRS)14,15和波谱成像(Resonance Spectroscopy)16可用于探测脑组织氧化还原代谢物浓度，为病变的早期检测提供依据。单光子发射计算机断面成像（Sing

23、le Photon Emission Computer Tomography, SPECT）的基本原理与 PET 相似，但是该技术检测的是放射性氧化还原物质衰变时产生的伽玛射线17。与 MRI 相比，PET 和 SPECT 的共同缺点是较低的空间分辨率， 以及对放射性氧化还原物质的使用。他们的主要优点在于可以使用不同放射性的外源标记物质来标注氧化还原物质，具备一定的灵活性12,13,17。在神经科学氧化还原代谢研究领域，除了上述技术外，光学成像技术越现出其独特的优势和广阔的应用前景，可以实现在不同的空间层次上和尺度上动态、离体静态测量神经生理病理活动情况，其涵盖范围从微观的细胞行为到集群细胞网

24、络，从局部脑组织及功能回路到宏观整体的脑功能区域响应18,19。1.3 测氧化还原状态的荧光成像技术荧光成像（Fluorescence Imaging）技术是光学成像（Optical Molecular所独有的特异性、灵活Imaging）技术的重要组成部分之一，因其成像对象荧光性等特点使之特适合研究生命现象，导致该技术成为生命科学与技术领域快速发展的一个方向。荧光成像的原理是当荧光吸收到一定数量的激发光后，将会发射出比激发光波长稍长的荧光，再用高通量的带通滤光片把激发光和的发射荧光来，达到荧光成像之目的20。（发射光）区荧光团是荧光成像中最小的发光单元，通过吸收能量被激发到高能态，高能态稳定性

25、欠佳又回到低能态同时能量，这些能量部分以光子的形式发射出来。其中，激发指的是在一定的条件下，荧光团的电子吸收能量（如光能、电能、热能、机械能等，以辐射能为主）后跃迁到较高能级（激发态）的过程。但是，由于处于激发态的电子往往是欠稳定的，它总是要想回到基态，当激发能量没有后的一段时间内，它将会向基态跃迁，并将多余的能量出去。跃迁方式既可以辐射跃迁，又可以非辐射跃迁。以非辐射跃迁方式跃迁时，能量多数转化为热能，而以辐射方式跃迁的，能量转化成相应波长的光的过程就是发射。荧光团的激发正是辐射跃迁的方式，当荧光团受到入射光（波长为 ex，能量为 hvex）激发以后，荧光团吸收激发光的能量，跃升至3华技 大

26、 学高能级，当荧光团由激发态重新跃迁回基态时，出吸收激发光的多余能量，这种能量的过程将会放出波长更长的荧光（波长为 em，能量为 hvem）20，如图 1-1所示。高能级低能级图 1-1荧光受激发后发射荧光过程示意图20Fig.1-1 The process schematic diagram of the fluorescence-emission after fluorescent molecular stimulated 20目前，大部分荧光探针需要体外成像技术都是对外源性荧光后标记才能识别，而内源性荧光进行成像，而外源性荧光无需外源性标记就可以用于氧化还原代谢状态的实时监测21,43。

27、在组织细胞线粒体整个氧化还原代谢过程之中，需要吡啶核苷酸和黄素蛋白这两种辅酶进行调节。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide， NAD+) 或称辅酶 I（CoI），是氧化代谢中连接作用物与呼吸链的重要环节1,21,22。如图 1-2 所示，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD+和还原型腺嘌呤二核苷酸 NADH 在光谱上有巨大差异：NAD+的激发谱和发射谱在谱段内无明显差异，呈水平分布，几乎没有波谱峰值存在，且荧光强度明显弱于 NADH；NADH 的激发谱和发射谱峰值差异很大，激发波段在 300 nm -380nm，峰值在 360 nm；发射波段在

28、 420 nm-480 nm，峰值在 460 nm。由于 NAD+和 NADH 等荧光物质的浓度与荧光强度呈线性关系，并根据这些光谱学性质，可通过在 360 nm 附近激发 NADH，并收集 460 nm的多寡 23。的荧光信号，便可根据荧光信号的强弱荧光4华技 大 学黄素蛋白（Flavoprotein，Fp）种类很多，其辅基有两种，一种为黄素单核苷酸（Flavin Mononucleotide，FMN），另一种为黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide， FAD），两者均含核黄素(维生素 B2)1,3,24。黄素蛋白参与呼吸链组成，与电子转移有关。如图 1-

29、2 所示，氧化型的黄素蛋白和还原型的黄素蛋白在光谱上也有很大差异， 且刚好与吡啶核苷酸相反：还原型的黄素蛋白的光谱的激发波段和发射波段几乎没有峰值，且荧光信号强度明显弱于氧化型的黄素蛋白。氧化型的黄素蛋白在激发波段和发射波段有明显的峰值，其激发波段是 445 nm-470 nm，激发峰值是 455nm；发射波段是 490 nm-580 nm，峰值是 520nm。同理，可通过 455 nm 激发并收集 520 nm 的荧光，再根据信号强弱黄素蛋白多寡24。图 1-2氧化型和还原型的吡啶核苷酸和黄素蛋白的激发谱和发射谱25Fig 1-2 Excitation spectrum and emissi

30、on spectrum of oxidized and reduced pyridine nucleotide and flavoprotein 25因此，可以利用内源性荧光如图 1-3 所示25。成像技术检测动物组织线粒体氧化还原代谢状况，CO COCOOH + 4NAD+ + FAD + 3H O ¬¾P¾D®H4NADH+FADH+4H+3CO3222LipDHfluorfluor360 ® 460nm460 ® 560nm技术原理25图 1-3 检测两种辅酶浓度的荧光Fig 1-3 Fluorescent molecules

31、technical principle of detecting coenzyme concentration 255华技 大 学由于位于组织细胞线粒体内呼吸链中的吡啶核苷酸和黄素蛋白在其氧化或者还原状态时显示出不同的光谱特征，故可对各种组织的氧化还原代谢状况进行在体或者离体监测。组织中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化还原状况是 ATP 形成率的一个指示剂。1955 年，Chance 和 William 等通过组织匀浆技术定义了离体线粒体中氧气、ADP、底物等代谢中间产物的状态22,26。经过对大鼠肝脏线粒体悬浮液的 NADH 荧光信号的检测，表明：荧光信号强度依赖于线粒体中 NADH 的氧化还原代

32、谢状态。状态 5：当线粒体乏氧时，NADH 的荧光信号强度变化不明显，可理解为 NAD+已经全部还原成 NADH，赋值为 1，即 100%。状态 4：粒体静息状况下获得的荧光信号较强，接近 99%。状态 3：线粒体由静息转换成活化时，NADH 的荧光强度降低，达到 53%。状态 2：当线粒体的底物（还原当量）时，NADH 的荧光强度进一步降低，可理解为 NADH 绝大部分被氧化成 NAD+，赋值为 026。如图 1-4 左侧所示。图 1-4 离体和在体情况下 NADH 的荧光强度与线粒体代谢状态之间的关系图26,27Fig. 1-4 The relation diagram between N

33、ADH fluorescence intensity and Mitochondrial metabolic status in vivo and ex vivo 26,27如图 1-4 右侧所示，1984 年，Mayevsky（麦耶夫斯基，以色列）在大鼠露的大脑皮层上进行了在体的 NADH 荧光强度的监测，结果发现：在体 NADH 荧光信号强度是连续变化的，难以分为几个阶段，与离体检测不一致的。而与离体结果一致的是，变化的趋势是一样的。在缺血乏氧或者状态时，NADH 荧光信号强度最大，类似6华技 大 学于状态 5；低氧、局部缺血乏氧或者局部缺血引起的皮层扩散性抑制时，NADH 荧光信号强度有

34、所降低，接近状态 4；麻醉或者清醒状态时，NADH 荧光信号强度介于状态 3 和状态 4 之间；在高压氧、解偶联剂等作用或者癫痫发生时，NADH 荧光信号强度进一步下降，接近状态 327。1962 年，Chance 及其同事首次露的大脑皮层、肾脏表面和其他多种了使用表面荧光检测仪器在原位麻醉大鼠暴组织上进行的 NADH 荧光信号探测结果，证明了氧气对组织中线粒体 NADH 的氧化还原状况的影响，以及 NADH 氧化还原状况的变化与大脑皮质电活动之间的关系28,29,30。NADH 荧光强度变化与大脑的活力状态相关联的研究结果表明：癫痫等痉挛性行为、直接物理或者化学刺激皮质或者大脑皮层扩散性抑制

35、等行为都将引起 NADH 荧光信号强度的瞬间变化，提示 NADH浓度也在瞬间改变31,32。1972 年，Chance 及其同事首次将光纤技术引入到 NADH 荧光信号强度的检测中，开始检测清醒动物脑组织表面或者其他的表面和内部的NADH 荧光信号强度33。但是大脑皮层之下乃至整个大脑的氧化还原状态在生理或病理过程中如何演变，我们还知之甚少。1985 年，Chance 及 Quistorff 等人设计和研制的低温扫描荧光成像系统（HighSpatial Resolution Automated Low-Temperature Redox Ratio Scanning Instrument）一直

36、是研究冷冻组织二维断面和三维立体氧化还原状态成像的“黄金标准”25。1999 年， Shiino 和 Chance 等人以正常沙鼠为研究对象，应用低温扫描荧光成像系统对沙鼠的大脑进行了三维氧化还原比率成像，发现鼠脑的氧化还原比率在脑组织中存在区域差异性，并肯定这种区域差异性来自脑组织本身的氧化还原状态的区域差异性34。2002年，Yueqing Gu 和 Britton Chance 改进成像系统，使得其既可以对内源性荧光成像，又可以同时对外源性荧光探针进行成像，并命名为高分辨率三维扫描光学成像系统（High-resolution three-dimensional scanning opti

37、cal image system）35。2009 年，HeN. Xu 和 Britton Chance 引入 CCD（Charge-coupled Device，电荷耦合元件）对弱荧光信号进行探测，搭建基于 CCD 探测的氧化还原状态成像系统（CCD-based redox imager），大大地缩短了成像时间，提高了时间分辨率，降低了液氮的损耗36,37。检测 NADH 的荧光强度已经被广泛地应用于评价组织的代谢状态和组织内的氧分压等参数，但是检测单个荧光物质的信号强度的绝对值存在缺陷，表现在检测仪器的误差和组织内的其它内源性荧光物质发射波段重叠等有可能会引起的误差。如前文所述可知：氧化型的

38、黄素蛋白的荧光信号强度要高于还原型的黄素蛋白的荧光信号强7华技 大 学度，而作为氧化还原反应中呼吸链的另外一种主要辅酶吡啶核苷酸而言，情况则刚刚相反，即还原型吡啶核苷酸的荧光信号强度要强于氧化型吡啶核苷酸的荧光信号强度。作为呼吸链中的两种主要电子传递载体，还原型吡啶核苷酸和氧化型黄素蛋白之间的 荧光信号强度的比值正好代表了组织细胞线粒体内的氧化还原反应的还原型电子载 体与氧化型电子载体的比值，这更能客观反映组织细胞内的氧化还原反应状况。因此， 很多研究采用的氧化还原比率 NADH/(NADH+Fp)和 Fp/(Fp+NADH)来作为更为准确直观地反映组织细胞内氧化还原反应状态的敏感的指标25-

39、29。1.4 大样品低温速冻技术概述由于体内生化反应的速率很快，要固定脑组织氧化还原代谢状态，需要较快的速率才能迅速维持氧化还原状态在某一时刻不变。快速固定脑组织氧化还原代谢的方法有快速降温固定法（ Rapid Freezing Fixation Technique ）、微波辐射（ Microwave Irradiation）固定法等方法38-41。降温固定法的原理是通过降低组织的环境温度来降低细胞内生化反应的速率达到固定组织代谢速率之目的。微波辐射固定法的原理是通过升高组织的温度使得细胞内酶失活而使得胞内生化反应停止以达到固定组织代谢状态之目的。两种方法各有利弊，由于固定好的组织会在液氮环境

40、中保存来维持其被固定的状态，加之降温法的程序比微波加热法更为简化、环保。采用快速降温固定组织的方法主要是超低温制冷剂快速冷冻，其目的是完全化（Vitrification）38,39,40。一般而言，液态物质需要被冷却直至会有如下两种不相同的方式：第式是需要液体需要经过相变。即，液体从液相开始进行不连续的低温过程，先形成晶体再变成固体；另一类方式是液体完全不需要经过液相-固相的相变过程，液体直接可以从液相进行连续不断地快速低温成体（仍是化转变38,39,40。液相，但粘度极高）。这个过程就被称做为虽然说化固体只是一类处于亚稳态的非固相却了的液体，但是由于化固体的黏度要比一般的液体高约 1015

41、倍，因此在实用的数十年的时间范围内，通常被认为是稳定的。对于不同的液相物质，实现液体的完全化转化所需要的冷冻速率相差非常大。例如，对于二氧化硅这种物质，只要 103 /s 的冷冻速率就可以将 2 m厚的二氧化硅材料实现整体完全化；而要实现 3.5 cm 厚的二氧化锗材料的完全玻璃化，却只需要 0.35 /s 的冷冻速率。但是对于纯水而言，即使高达 107 /s 的冷冻8华技 大 学化固体38,39,40。速率也难得到 1 m 的完全化的途径示意图38-40图 1-5 水溶液的补充相图以及实现完全Fig.1-5 The aqueous phase diagram and the aqueous

42、glass transition diagram 38-40化的难度非常大。如图 1-5生物组织都是含水量非常高的系统，要实现完全所示，给出了常见液相物质水溶液的补充相图。其中，Tm 指的是液相水的凝固温度；Th 指的是液相水的均相成核温度；Tg 指的是液相水的化转化温度。在此，科学家们已将这个反映液相水溶液的动力学性质的非平衡亚稳状态数据的化温度加在了相图之上，故称之补充相图或者固液态图38,39,40。化转目前探索的实现水溶液化转变的途径大致有三种38,39,40，将其综述并列表如表 1-2 所示：化转变的三种途径38,39,40表 1-1实现水溶液Table.1-1 Three meth

43、ods to realize the aqueous glass transition 38,39,40途径方法条件适用对象102-103K/s Tm-Tg>100K避免溶液损失完全化法极高的冷却速率体积较小的细胞20%以下的溶液稀溶液部分化法两步法冷却先慢速再快速化溶液法化溶液保护溶液浓度高细胞、组织无化学损伤由此可知：对于脑组织这样的大组织要实现化，“完全化方法”是不现实9华技 大 学的，“两步冷却法”和“化溶液方法”是可以尝试的。但是如果是要快速固定脑组织的氧化还原代谢状态，“两步冷却导致内部组织和外部组织被冷却的时间存在一定的时间差，当外部组织先冷却后将会导致内部组织由于缺血乏氧

44、等导致内外组化溶液灌注织代谢而存在较大的实验操作性误差；“化溶液方法”需要预先将到脑组织，考虑到脑屏障和灌注的溶液会引起组织代谢状态改变等因素，因而也不适宜固定脑组织代谢状态。在目前还不能对脑组织化时，传统固定脑组织代谢状态的方法有：断首液氮速冻法（Decapitation into Liquid Nitrogen）、液氮直接速冻法（Rapid Freezing the Intact Animal）和漏斗式液氮速冻法（Funnel Rapid Freezing）41。将其综述并列表如表 1-2 所示：表 1-2 三种固定脑组织代谢状态的方法41Table.1-2 Three methods t

45、o fix the tissue metabolic status 41方法优势不足断首液氮速冻法迅速、廉价组织乏氧自溶无需专业设备刺激中枢神经液氮直接速冻法操作简单、成本低层组织乏氧自溶无需任何专业设备体重不超过 40g设备昂贵， 需要麻醉漏斗液氮速冻法持续供应血氧实时监测生理参数操作复杂，时间较长1.5本课题的主要研究内容本研究基于鼠脑组织乏氧后线粒体中呼吸链偏向还原状态的特性，性地对线粒体中两种重要辅酶还原型荧光NADH 和氧化型荧光Fp 进行激发荧光成像，采用搭建的多通道低温三维荧光显微成像系统对鼠脑的氧化还原状况进行ex vivo 二维断层成像。本课题受到自然科学基金（3080148

46、2），光电实验室 基金（2009，张智红）和 111 计划（B07038）的资助。第一章的绪论中分析了胞内糖氧化还原代谢过程以及调节组织细胞线粒体氧化还原反应进行过程中的两种关键辅酶 NADH 和 Fp 的物理化学性质，阐述了利用NADH 荧光信号强度评价线粒体氧化还原状况的意义，提出了采用氧化还原比率综合10华技 大 学评价氧化还原状态，综述了脑氧化还原状态研究的历史和进展。并分析了采用快速降温方式样品的原理和机制，论述了液氮低温环境下快速冷冻脑组织代谢状态的三种常见方法及其特点。最后介绍了本文的主要内容。第二章介绍了漏斗法、断首法和直接冷冻法三种液氮低温环境鼠脑样品的方法。通过对三种鼠脑方

47、法和流程、成像结果的论述，讨论并筛选出最佳固定鼠脑组织线粒体氧化还原状态的方法。第三章介绍低温成像环境的维持技术方法原理及其实现过程。本章主要从低温环境能够存在的条件出发，介绍了低温环境实现的方法，以及低温下样品固定模块、组织样品代谢状态被固定后低温环境维持模块、低温成像环境优化模块等低温环境各主要组成模块的设计及实现方法。第四章介绍乏氧致死鼠脑及其对照组正常鼠脑在低温环境下进行显微荧光成像的过程及其结果。低温荧光的区域差异性。成像技术探索不同生理状态下鼠脑组织氧化还原状态第五章对本文内容及作者所做的工作进行了总结，重点介绍了研究内容和创新之处，并对本研究的意义和发展方向进行了展望。整个的内容

48、和文档组织结构如图 1-6 所示。11华技 大 学第一章：绪论介绍了荧光成像技术的原理、组织线粒体氧化还原过程及其代谢状态的检测历史和进展、应用液氮低温技术固定组织代谢状态的优势和方法，最后介绍了本 文的主要研究内容。第二章鼠脑样品低温第三章低温成像环境维持方法方法第四章：鼠脑氧化还原状态的低温成像第五章：总结与展望总结了本文主要内容，并对本研究的意义和发展方向进行了展望。图 1-6 本文主要内容和结构示意图Fig.1-6 The main content and the structure schematic drawing12华技 大 学2鼠脑样品的低温方法2.1引言生命体氧化还原代谢过程

49、的实质就是呼吸链中电子的传递过程，其特点就是电子传递速度快，且依赖于辅酶，因此，辅酶的数量在一定程度上就表征组织的代谢状况。即，辅酶数量越多，其代谢的活力越强。某种辅酶越多，组织代谢状态的偏向性越加明显。由于电子的速度极快，组织的氧化还原状态也是个极快动态变化的过程。因此，氧化还原代谢状态研究的关键就在于样品状态。时如何迅速固定组织的氧化还原实验动物样品是整个研究的关键环节之一，是决定整个研究成败的关键之所在41,42,45,47。而大样品的氧化还原状态的迅速固定是决定整个样品的氧化还原状态均匀固定状况的前提。因此，需要寻找一种可以迅速固定大样品的氧化还原状态的样品方法。本章将比较鼠脑模型的断

50、首法、漏斗法和直冷法三种方法，寻找适合本研究的样品方法。2.2 固定组织氧化还原状态的低温技术一般的冷冻实验样品的流程是先取材再固定，但是由于本研究是大样品组织氧化还原代谢状况而开展的工作，通常的取材操作均会影响组织的代谢状态，使其不能接近其生活状态，因此本研究需要先固定后取材。通常的固定操作是用乙醛、戊二醛、重铬酸钾、升、锇酸等对组织进行浸泡或者灌注，而这些物质会对组织的代谢状况带来不确定的影响，故本研究不能采用这些化学固定方式38,42,44。组织氧化还原代谢，是生命活动的一种重要体现形式，归根到底都是酶催化的一系列生物化学反应，其本质就是电子的得失。要想固定组织的氧化还原代谢过程，首当其

51、冲就需要降低电子的速率，即，使得组织细胞内的生物化学反应速率降低甚化学奖获得者 Svante August Arrhenius （斯范至完全停止。著名物理化学家特·奥古斯特·阿累尼乌，瑞典）在长期研究温度对化学反应速度的影响后，得出Arrhenius 关系式38：13华技 大 学 Ea（2-1）k = A · eR T其中 k 是化学反应速率；R 是气体常数，约为 8.314 kJ/(Kmol·K)；T 是绝对温度；Ea 是活化能；A 是 Arrhenius 因子，对于给定的反应，A 是个常数。由 Arrhenius 关系式可知：化学反应速率与其活化能的

52、大小和温度的高低密切相关，活化能越低，反应速率越快，因此降低活化能会有效地促进反应的进行。酶通过降低活化能（实际上是通过改变反应途径的方式降低活化能）来促进一些原本很慢的生化反应得以快速进行。一般而言，温度可以影响酶的活性。高温使得酶失活，低温使得酶的催化效应被抑制。酶催化效应的降低势必将导致活化能的升高，并将进一步降低氧化还原反应的速率。根据 Arrhenius 关系式（2-1）计算，可以得到生化反应速率与温度的关系，即可以得到生物氧化还原速率与温度的关系38。如表 2-1 所示。表 2-1 温度与氧化还原代谢率关系表38Fig.2-1 Relation table of temperatu

53、re and redox metabolic rate 38氧化还原代谢率的比率温度（）等量代谢物被消耗时间（相对液氮环境下）7.8×10143.6×10141.5×10142.7×10121.7×1095.8×105137（体温）20（室温）0（冰点）-65（冷冻切片机）-128（四氟化碳凝固点）-164（甲烷沸点）-196（液氮沸点）1 s2.15 s5.19 s4.85 min5.21 days42.71 years 2.46×1010 years如某一生物体的代谢底物在 37 环境下可以代谢 1 秒钟，假定其代谢速率

54、在液氮环境下为 1。那么根据理论计算，该生物体在 37 下的代谢速率是液氮环境下的7.8×1014 倍，同样多的物质在液氮环境下需要 2460 万年才能代谢完。根据 Arrhenius 关系式，通过低温技术，可以将生物组织的物质代谢和氧化还原14华技 大 学代谢固定在冷冻前的一刻，这是低温成像技术的一个优势。低温是物理学上的一个概念，在引入到生物和医学后，其所覆盖的温度范围变宽泛了，包括从稍低于正常体温（37 ）直到低于 4 K（-269 ），如低体温医疗技术的温度一般是稍微低于 37 ，动植物耐寒性研究中的低温范围在 0 左右，而组织低温保存、肿瘤低 割技术的低温范围却需要低至-19638-40。低温技术，一是需要一个低温环境，二是需要合适的制冷剂。低温环境的构建关键在于绝热，这个问题将在第三章系统分析。在此只分析制冷剂。低温技术中根据所需低温环境的温度值和样品所需的温度值，有很多种制冷工质可供选择38。表 1-1 列举了常见的几种制冷工质及其物理参数。表 2-2常见制冷工质凝固点和沸点表38Table.2-2 Common refrigerant freezin