巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略

1、巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略1 .巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。P.pastoris能根据细胞生长环境(碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫)来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质

2、蛋白酶体中。但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶(cell-boundproteases)和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶(vacuolarproteases),细胞基质蛋白酶体(thecytosolicproteosome)以及分

3、泌途径的蛋白酶(proteaseslocatedalongthesecretorypathway)。表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶Table1.2ProteasesofPichiapastorisvacuoleandsecretorypathwayEnzymeTypeGeneZymogenformVacuolePrAAsparticPEP4YesPrBSerinePRB1YesCpYSerinePRC1YesCpSMetallo-(Zn2+)CPS1UnknownApIMetallo-(Zn2+)LAP4YesApCoMetallo-(Co2+)DAP2NoDPAP-BSerine

4、SEC11UnknownSecretorypathwaysignalpeptidaseKex2proteaseSerineKEX2YesKex1carboxypeptidaseSerineKEX1NoDPAP-ASerineSTE13Unknown,predictnoYeastaspartylproteaselAsparticYAP3Unknown,predictyes酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80%的蛋白在液泡中降解。在P.

5、pastoris生长和表达外源蛋白过程中，由于碳源从葡萄糖或甘油到甲醇的改变，甲醇代谢酶系(AOX,FAD,DHAS等)和过氧化氢体逐步积累，同时，相应的蛋白酶也产生了。由于细胞器胁迫的影响，过氧化氢体一部分在基质中自噬降解，大部分过氧化氢体转运到液泡中得到降解。P.pastoris中位于与细胞膜结合的胞内蛋白酶类可分为蛋白质水解酶(内切酶)和多肽外切酶，由蛋白酶，竣肽酶，氨肽酶类组成。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前体经过酶切活化而成，按照其作用活性位点又分为4类，丝氨酸类蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸类蛋白酶和天冬氨酸类蛋白酶。丝氨酸类蛋白酶最适pH值比较高，又叫碱性蛋白酶，而天冬氨酸类蛋白酶需

6、要低的pH范围，又叫酸性蛋白酶。主要的液泡内蛋白酶有以下几种：蛋白酶A(proteinaseA,PrA),蛋白酶B(proteinaseB,PrB),竣肽酶Y(carboxypeptidasesY,CpY),竣肽酶S(carboxypeptidasesS,CpS),氨肽酶I(aminopeptidasesI,Api),氨肽酶Co(aminopeptidaseCo,ApCo),二肽氨肽酶B(DipeptidylaminopeptidaseB,DPAP-B)。蛋白酶A,分子量约42kDa,是天冬氨酸类蛋白酶，由基因PEP4表达，其前体能自身催化而形成成熟的蛋白酶，并催化竣肽酶Y前体和蛋白酶B前体形

7、成竣肽酶丫和蛋白酶B;蛋白酶B,分子量约32kDa,丝氨酸类蛋白酶，由基因PRB1表达，又基因PRB1克隆和测序发现是一个很大阅读框，编码一个最少69kDa的前提，其前体有50%的自身催化成蛋白酶B,另一部分由蛋白酶A催化；蛋白酶A和蛋白酶B是液泡中最基本的蛋白酶，是其他蛋白质水解酶的激活剂。竣肽酶Y,是丝氨酸类蛋白酶，由基因PRCI编码，其生物合成，液泡内分拣和CPY的加工成熟目前研究很清楚。PRCI基因编码的竣肽酶Y前体包含一个N-端信号肽，一个含90个氨基酸的前肽和一个含421个氨基酸的酶活区域。竣肽酶Y前体经过高尔基体后切除糖链得到一个69kDa的中间体，然后在液泡中切除前肽形成61k

8、Da成熟的竣肽酶Y。竣肽酶Y前体(67kDa)没有生物活性，必须在蛋白酶B作用下或蛋白酶A与蛋白酶B共同作用才能形成成熟的竣肽酶Y。竣肽酶S,是一个由基因CPSI编码，依赖于金属离子的竣肽酶，分子量7377kDa,其合成与膜和内质网相关。氨肽酶I,由基因LAP4编码，是一个含有12个亚基分子量为640kDa的金属多肽，氨肽酶Co是一个分子量为100kDa的Co2+金属多肽，其机理目前不清楚。二肽氨肽酶B,由基因DAP2编码的膜接合液泡蛋白酶，在传递到液泡前没有蛋白酶活性。酵母液泡中的各种蛋白酶量会随着发酵过程中营养条件的改变发生变化，如发酵过程中的饥饿胁迫、碳源改变、热和pH变化及有毒有害产物

9、的形成等。分泌到胞外的重组蛋白降解有可能是由于蛋白酶的过表达而部分分泌到胞外所致和高密度培养时细胞自溶造成膜破裂而释放出蛋白酶两种因素引起。在Sinha的研究中发现当P.pastoris从甘油生长阶段转为以甲醇为碳源诱导表达阶段时，培养基中的各种蛋白酶量明显增加，远高于一直以甘油作为碳源的实验对照组。基质蛋白酶体，又称蛋白体，多蛋白酶复合体，多催化功能蛋白酶，存在于真核细胞内，主要完成蛋白酶水解途径的中间过程，其中20S的蛋白酶体，位于所有真核生物的细胞核和细胞间质中，是一个分子量为700kDa圆柱形颗粒，由14个不同的亚基折叠缠绕而成。26S蛋白酶体是一个巨型蛋白酶复合物，分子量高达1700

10、kDa,主要降解依赖ATP的泛醍类蛋白质，它是由2个19S蛋白酶体连接到20S蛋白酶体两端构成，它们主要负责短周期的蛋白质的分拣和快速降解，包括某些对细胞有害的蛋白质。液泡和蛋白酶体降解的互作是调节细胞过程的一个重要方式，特别是对细胞胁迫的响应方面。分泌途径的蛋白酶主要分布在高尔基体和细胞质膜上，其功能是去处去除蛋白酶前体上的多肽，主要的蛋白酶有信号肽(Signalpeptidase),Kex2蛋白酶(Kex2Endoproteas),Kexl竣肽酶(Kexlcarboxypeptidase)二肽氨肽酶A(DipeptidylAminopeptidaseA,DPAP-A),酵母天冬酰胺蛋白酶I

11、II(YeastAspartylProteaseIII,Yap3Protease)。信号肽是一个最少包含4个亚基的完整的膜蛋白。Kex2蛋白酶，由基因KEX2编码，其功能是切除COOH-端的Lys-ArgorArg-Arg键残基。Kexl竣肽酶，由基因KEXl编码，是一个特异性的丝氨酸类蛋白酶，二肽氨肽酶A,由基因STE13编码的膜蛋白，酵母天冬酰胺蛋白酶III,其功能是在Kex2蛋白酶的作用下，切除受体COOH-端a因子前体。在发酵过程中，由于高密度细胞的影响以及部分细胞的裂解，液泡中的蛋白酶常释放到培养基中，导致目的蛋白的降解。在发酵的过程中，随着外源蛋白在培养基中的浓度不断提高，蛋白水解

12、酶浓度也随着升高，对外源蛋白产生降解作用。因此，防止蛋白水解酶的水解作用，提高外源蛋白的稳定性，减少外源蛋白的损失，也就相对地提高了外源蛋白的产量。2 .巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解控制策略蛋白酶降解是酵母表达系统的共有一个缺陷，降解不仅能引起目的蛋白的产率下降，降解形成的片断还能造成分离纯化极大困难，特别是与目的蛋白分子量大小相差很小的降解产物，由于它们的理化性质接近，常规的分离方法很难将它们分离开来，导致产品收率大大下降，产品纯度低，蛋白的比活性降低。几乎所有在酵母中表达的重组蛋白都或多或少地存在表达蛋白降解问题，只是程度不同而已。而表达蛋白发生降解的不同程度往往是由于发酵培养条件和发

13、酵控制方式不同所致。尽管降解程度有所不同，但引起蛋白降解的直接原因是酵母细胞自身存在的各种蛋白酶。蛋白质的降解常引起目的蛋白产率的减少，生物活性的降低，并在分离纯化过程中降解产物由于类似的物化或亲和性质而造成产物污染。P.pastoris表达外源蛋白时的蛋白降解控制策略日益受到重视。为避免蛋白酶的降解，不同的策略得到应用，如2使用蛋白酶缺陷菌株(proteasedeficientstrains),对蛋白质结构进行修饰(modificationoftheproteinstructure),添加蛋白酶抑制剂(additionofproteaseinhibitors)，改变培养基pH(changin

14、gthepHoftheculturemedium)以及添加在培养基中补加，如酪蛋白水解物(Casaminoacids)、蛋白月东(yeastpeptone)等一些富含氨基酸和多肽的组分。归纳起来可以分为三种水平策略：培养水平(cultivation-levelstrategies),细胞水平(cellular-levelstrategies)和蛋白质水平策略(protein-levelstrategies)。2.1 培养水平策略提高分泌蛋白的稳定性可通过改变培养基的pH来加以改善。P.pastoris的pH适应范围比较广，可以在pH2.87的范围内生长。不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范围，选

15、择适当的发酵pH可以不影响细胞的生长，但可降低蛋白酶活性，减少目的蛋白的降解。P.pastoris在pH3.0条件下发酵重组水蛭素比pH5.0下的降解少。pH6.0最适人表皮生长因子和白蛋白的表达，在pH3.0最适人胰岛素样生长因子、CD4蛋白的V1亚基表达，而咖啡豆半乳糖昔酶在pH45不降解，pH高或低均降解，pH3.0最严重。低温能影响目的蛋白的产量，主要是由于温度较高时，重组蛋白不稳定，以及死细胞释放的蛋白酶的活性增强。Li等实验说明将培养温度从30c降低到23c时，毕赤酵母表达鳞鱼抗冻蛋白从5.3mg/lt升到18.0mg/L,同时也发现活细胞率(cellviability)增加。Ho

16、ngetal.通过降低发酵温度(从30c降到20C)使表达的laccase活性增强。Jahicetal应用温度限制流加发酵技术(atemperature-limitedfed-batchtechnique,TLFB)获得了更高浓度的融合蛋白，同时细胞死亡率和蛋白酶活性都降低。通过添加特异性蛋白酶抑制剂也可减少目的蛋白的降解。Shietal利用毕赤酵母表达抗Mamestraconfigurataserpin单链抗体(scFv)时候，鉴定到存在三种蛋白酶类，即天冬氨酸型蛋白酶、半胱氨酸型蛋白酶及丝氨酸型蛋白酶。通过添加丝氨酸蛋白酶抑制剂，发现发酵液总蛋白酶活性下降53%,添加天冬氨酸蛋白酶抑制剂，

17、总蛋白酶活性下降30%。不过，大规模表达外源蛋白时添加特异性蛋白酶抑制剂使生产成本大幅度上升。另外，尽管特异性蛋白酶抑制剂可提高产物的稳定性，但必须注意的问题是蛋白酶抑制剂与培养基的结合能显著改变部分蛋白组成。例如加入5mMEDTA到毕赤酵母发酵液培养时会引起一个分子量近50kDa的蛋白分子在发酵液中的积累，该蛋白序列与S.cerevisiae和Candidaalbilabs的exo-B-1,3-glucanase序列很接近。在培养基中补加一些富含氨基酸和多肽的组分，如酪蛋白水解物(Casaminoacids)、蛋白月东(yeastpeptone)、胃蛋白酶水解物等，为蛋白水解酶提供过量的底物

18、，以减少目的蛋白的降解。加入Casaminoacid或YP到培养基中，进一步提高产物的稳定性。把培养基中的pH从5.2增加到6.0,则可显著提高分泌的rHSA产量，再加入YP又可提高其表达的产量。通过添加1%Casaminoacids,mouseepidermalgrowthfactor(mEGF)表达量显著提高。对于是加入Casaminoacid还是加入YP,通常认为最好加入Casaminoacid,因为YP的肽组成会影响产物的分析和提取。直接添加氨基酸也能有效防止目的蛋白被降解。Won-AChoi等认为0.3ML-Arg和L-Lys能够有效地防止目的蛋白被胞内蛋白酶酶解。发酵时控制一定的比生长速率，或利用连续培养的发酵方式。细胞比生长速率同样可影响目的蛋白的降解。通过控制诱导相比生长速率为0.02-0.047h-1,即相应的甲醇浓度为3.09g/L时候，毕赤酵母表达水蛭素的降解可控制到最小程度。2.2 细胞水平策略产物的稳定性也可通过改造毕赤酵母表达宿主的蛋白酶缺陷型菌株来提高。如SMD1168(his4,pep4)、SMD1165(his4,prb1)和SMD1163(his4,pep4,prb1)。这些菌株在编码