第三章 常压柱分离技术

1、一柱色谱分离技术分类一柱色谱分离技术分类二层析柱的制备二层析柱的制备三样品的制备与上样三样品的制备与上样 四洗脱与分离四洗脱与分离五注意问题五注意问题 l 柱色谱分离与薄层色谱类似，是靠洗脱剂把分离的各组分逐个洗脱下来的过程，故也称洗脱色谱。l 由于色谱柱填充的吸附剂的量远远大于薄层板，因而柱色谱可用于分离量比较大（克数量级）的物质，而薄层制备色谱分离量比较小，一般在毫克数量级。所以作为较大量制备分离，柱色谱优于薄层色谱。l 在柱色谱分离过程中,一般利用薄层色谱摸索柱色谱的分离条件; 利用薄层色谱鉴定、分析和分段收集洗脱出的洗脱液中的成分。 柱色谱分离技术按色谱原理 可分为下列类型：l吸附柱色

2、谱l分配色谱，l离子交换色谱，l分子排阻色谱l 亲和柱色谱，等。 l 利用欲分离的混合物中各组分分配在吸附剂和洗脱剂之间，被吸附、分配、交换的性质不同，而相互得以分离。l 化合物被吸附、分配、交换的这种作用越强，该化合物溶解在洗脱剂中越少，沿洗脱剂移动的距离则越小。反之，越多。 l实验室常用的柱色谱有：l以硅胶和氧化铝为吸附剂的吸附柱色谱；l以硅胶、纤维素和聚酰胺为载体（支持剂），以其吸收较大量的液体作为固定相的分配色谱（这里支持剂本身不起分离作用）。l以葡聚糖凝胶为固定相的分子排阻柱色谱；l以离子交换树脂为固定相的离子交换柱色谱等。l主要介绍以硅胶和氧化铝等为吸附剂的吸附柱色谱l色谱柱的大小

3、，取决于被分离样品的量和吸附色谱柱的大小，取决于被分离样品的量和吸附剂的性质，要根据实际应用而定剂的性质，要根据实际应用而定 l1玻璃色谱柱玻璃色谱柱 l 用前洗净，干燥。柱子底铺一层玻璃丝或者用前洗净，干燥。柱子底铺一层玻璃丝或者脱脂棉（有沙芯者可不用），然后放一层脱脂棉（有沙芯者可不用），然后放一层 (0.5-1cm)海沙（海沙（sea sand）（也称石英沙）。）（也称石英沙）。 l2装柱装柱 常压柱层析装柱方法有两种l(1) 干法装柱干法装柱l(2) 湿法装柱湿法装柱 所用吸附固定相一般为硅胶，氧化铝，粒度要求100-160目或160目以上。 吸附剂粒度越小，分离度越大，但洗脱速度，越

4、慢。 Rf值相差较大时，应用硅胶100-160目，可上样30mg/g硅胶，更多的情况下硅胶量为10mg/g硅胶（即分离1g 样品需要100g 硅胶）。 应用氧化铝时，粒度要求100150目，分离1g样品需要2050g氧化铝。 l 干法干法在柱子上端放一漏斗，直接加入硅胶，轻轻敲打层析柱，或上下震动层析柱，使填装均匀，再加一层海沙，然后加入洗脱剂，使硅胶润湿（溶剂化）. 必要时加压或减压以除去气泡，加速溶剂化速度。溶剂化后的硅胶柱，均匀透明. 湿法湿法将吸附剂硅胶与一定量溶剂调成悬浆状，快速倒入柱管中，打开活塞，使溶剂慢慢流出，吸附剂慢慢下降而均匀沉入色谱柱底。l吸附剂填料完毕,一般在上面再覆盖

5、0.5cm厚的海沙。l无论干法或湿法装柱都要均匀，不能使柱子干了. 应使溶剂与海沙平面相齐。否则将会出现气泡或裂缝。 1被分离混合物为液体被分离混合物为液体 将其中极性溶剂尽可能的用旋转蒸发仪去除后，加将其中极性溶剂尽可能的用旋转蒸发仪去除后，加入少许流动相稀释。入少许流动相稀释。 待将吸附剂上面的多余洗脱剂放出，直到柱内液体表待将吸附剂上面的多余洗脱剂放出，直到柱内液体表面降至吸附剂表面时，停止放出洗脱剂。面降至吸附剂表面时，停止放出洗脱剂。 将样品溶液用滴管或漏斗沿柱子内壁直接加入柱中。将样品溶液用滴管或漏斗沿柱子内壁直接加入柱中。样品稀释要尽可能用少的洗脱剂，然后用最少量洗样品稀释要尽可

6、能用少的洗脱剂，然后用最少量洗脱剂洗涤器皿与层析柱内壁，洗涤完毕，开放活塞，脱剂洗涤器皿与层析柱内壁，洗涤完毕，开放活塞，使液体渐渐放出，液面降至吸附剂上端时，开始加使液体渐渐放出，液面降至吸附剂上端时，开始加入流动相洗脱。入流动相洗脱。 l2被分离混合物样品为极性较小的固体被分离混合物样品为极性较小的固体 lA. 尽可能使其溶于流动相溶剂中。但应注意，样品在流动相中的溶解度一般较小。如果样品体积太大，分辨能力就会降低。另一方面，如果样品浓度过浓，就可能在柱顶部形成沉淀。lB. 可选择极性较小的溶剂溶解后上柱. 可选用的溶剂: CH2Cl2, CCl4, 甲苯，环己烷，石油醚。 总之溶剂极性不

7、能比洗脱剂极性太大，否则将影响层析行为和分离效果或分不开。极性小的溶剂一般指在溶剂极性顺序中,极性小于二氯甲烷的溶剂; 另外溶剂量不能太多，以近饱和为宜。la.可选择极性大的溶剂溶解。如氯仿，丙酮，乙醇，甲醇，四氢呋喃，吡啶，免用DMSO, DMF沸点较高溶剂。lb. 再加入适量的硅胶于溶剂中（一份样品 + 约5份柱填料），用旋转蒸发仪减压蒸去溶剂至干，让样品均匀地涂布在固定相表面上，然后通过漏斗装于柱子上端。l旋转蒸发时，一定要加防爆球，以防样品硅胶爆沸。 l1洗脱剂的选择应以TLC检测为依据。l被分离物质的最佳 Rf值应在0.2-0.5 内 。l被分离的2个点之间Rf值应尽可能的大，越大越

8、好。最小应不小于 0.1。否则分离效果差或难以分离。l2洗脱剂应不断加入，保持一定高度。或加一储液烧瓶，以免流干。 l3洗脱液收集 洗脱液采用等份法收集，例如5，10，20，30或50ml为一份。根据分离样品多寡而定。用小试管或小容量瓶收集。l4控制洗脱液流出速度。不能太快，太快柱中交换来不及平衡，从而影响分离效果。一般以1-2滴/秒为宜。l5洗脱液TLC检测与合并。将每一个小容量瓶按编号点样展开，将Rf值相同者合并，浓缩-蒸干，最后进一步纯化（蒸馏或重结晶等）。 1吸附剂表面加入海沙的目的是使加料时不致把吸附剂冲起，影响分离效果。若无沙子，也可用玻璃纤维。l2层析法中最关键性的操作之一就是装柱（向柱内充填吸附树）操作。固体吸附剂如硅胶、氧能铝等柱填充料，柱子在充填时必须装得非常均匀，决不可装得不整齐、出现空气泡、存在隙缝等。因为一个化合物沿着柱子下行时，这些情况可能会出现在前沿域谱带的异常。 l（1）化合物谱带的最前面的边缘或称前沿应是水平的，或者说应是垂于柱的长轴的。l如果填充料填充不水平，或柱子末被夹持在两个平面中(即前后，左右两个平面)完全垂直的位置，第二条谱带的最前面的边缘在第一条谱带洗脱完毕之前就将开始洗脱出来了那么想分离每一组分是不