Elisa实验药品步骤及相关材料资料

1、本实验室Elisa所需试剂器材1 .试齐1J(1)包被缓冲液碳酸盐缓冲液(PH9.60.05M):Na2CO31.59gNaHCO32.93g加蒸储水至1000ml作用：稀释抗原(菌悬浮液)(2)洗涤缓冲液PBST(PH7.40.15M):KH2PO40.2gNa2HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2gTween-200.05%0.5ml加蒸储水至1000ml作用：洗涤(3)缓冲液PBS(PH7.40.15M):KH2PO40.2gNa2HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸储水至1000ml作用：制备封闭液(4) 封闭液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g

2、,加缓冲液(PBS)至100ml或PBS加2%BSA作用：封闭空隙(5)稀释?夜:PBST加1%牛血清白蛋白(BSA)作用：稀释抗体及酶标抗体(5)HRP羊抗兔IgG一酶标抗体作用：结合抗体(6)底物缓冲液磷酸盐柠檬酸(PH5.5):0.2MNa2HPO4(28.4g/L)25.7ml0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml蒸储水50ml作用：制备TMB(7) TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml0.75%H2O232dl作用：显色(8) 终止液(2MH2SO4)：蒸储水178.3ml,逐滴参加浓硫酸(98%)21.7m

3、l作用：终止反响2.器材：聚苯乙烯塑料板(酶标板)96孔抗原制备：以平板划线法将供试菌菌接种于普通营养琼琼脂培养基上,28c培养24h后,挑取单菌落接种于LB液体培养基中,过夜培养；5000rmin-1离心10min,弃上清；参加1%的甲醛于37C灭活24h,通过菌落涂布法检测灭活效果；5000rmin-1离心10min,弃上清,用麦氏比浊法,配制出浓度约为1M09cellsmL-1的菌悬液作为免疫抗原.抗血清制备：抗血清不能直接用于包被,应先提取IgG.大量工作说明,只用硫酸镂沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白.其根本步骤如下：(1)取抗血清0.2ml;(2)加生理盐水(0.85%N

4、aCl)0.3ml,混匀；逐滴参加饱和(NH4)2SO40.5ml,充分振荡混匀,4c静置1h;(4)10000rpm/min离心20min,弃上清；(5)加0.5ml生理盐水重悬浮,混匀；(6) 0.25ml饱和(NH4)2SO4,充分振荡混匀,4c静置1h;(7) 10000rpm/min离心20min,弃上清；(8)重复58步骤一次；(9)加生理盐水0.5ml重悬浮,混匀；(10)生理盐水中透析1224h;(11)在0.2MpH9.0硼酸缓冲液透析1224h;(12)分装,即将使用时4c保存,备用-20C保存.为最大限度保持抗体活性,整个过程应在4c下进行.对于冻干抗血清或长时间保存的血

5、清,将生理盐水透析改为3MKCNS透析,促使聚合的多聚体解聚.硫酸镂法纯化血清IgG粗品：取1份血清参加1份生理盐水进行稀释,边搅拌边参加2倍原血清体积的饱合硫酸镂,室温放置30min,7000r/min离心30min;沉淀溶于原血清体积的生理盐水中,参加1倍体积的饱合硫酸镂,室温放置30min,重复第二步,将沉淀溶于1/10原血清体积的生理盐水溶液中,在0.0175mol/LpH6.3PB缓冲液中透析至无NH4+为止.免疫血清效价的测定：采用试管凝集法测定抗血清的效价.ELISA检测流程：用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释抗原,参加96孔聚苯乙烯酶标反响板孔内,每孔100阅60

6、C烘干,用PBST缓冲液(注满孔)洗涤3次；每孔参加300科2%BSA-PBST封闭液,37C封闭1h,PBST缓冲液洗涤3次；每孔参加100L适当稀释的阳性血清和阴性血清,37c反响1h,PBST缓冲液洗涤3次；每孔参加100的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体,37c反响1h;PBST缓冲液洗涤3次；加新配制的TMB-H2O2底物溶液(临用15分钟内),每孔100wL37c避光反响20min；以50L2mol-1LH2SO4终止反响；15分钟内用酶标检测仪读取OD450值,以判定结果.抗原最正确包被浓度和免疫血清最适稀释度确实定：棋盘法：将1x109CFU/mL的菌体悬液梯度稀释至lxl05CF

7、U/mL,使抗血清做1:2000、1:5000、1：10000、1：15000、1:20000稀释.酶标抗体做1:1000稀释,每个稀释度包被3个孔,进行间接ELISA测定.以能产生OD450值为1.0左右,且P/N值最大的为抗原抗体最正确稀释度.酶标二抗最适稀释倍数确定：在确定的抗原抗体最正确工作浓度下,将酶标二抗稀释为1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:200005个稀释比试验,依据其OD450值在1.0左右的选择为最正确二抗稀释比,且P/N值最大为最正确稀释度.硼酸缓冲液一般PH6.779.24A液：0.2mol/L硼酸0.05mol/LNaCl配方：硼酸：1.

8、2368g,NaCl0.2925g,加蒸储水至100mlB液：0.05mol/L硼酸钠配方：硼酸钠1.907g,加方M留水至100ml/、同的PH值配方如下：PHA(ml)B(ml)PHA(ml)B(ml)6.779.70.38.415.54.57.099.40.68.515.05.57.369.01.08.604.56.07.608.51.58.694.06.07.788.02.08.843.07.07.947.52.58.982.08.08.087.03.09.111.09.08.206.53.59.24010.08.316.04.0透析袋使用前处理：1 .把透析袋剪成适当长度(10-20

9、cm)的小段.2 .在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟.3 .用蒸储水彻底清洗透析袋.4 .放在1mmol/LEDTA(pH8.0)中将之煮沸10分钟.5 .冷却后,存放于4度,必须保证透析袋始终浸没在溶液内.从此时起取用透析袋是必须戴手套.6 .用前在透析袋内装满水然后排出,将之清洗干净.透析膜(前处理方法如下)：1 .戴手套把透析膜剪成适当长度,浸在蒸储水中15min泡软.2 .浸入10mM碳酸氢钠中,并加热至80C,一边搅拌至少30min.3 .换到10mMNa2EDTA中浸泡30min,以新鲜的EDTA同样方法处理三次.4 .再

10、用80C蒸储水洗30min,然后换到20%酒精中,放在4C冰箱中保存.方法一：1、把透析袋剪成适当长度10-20cm的小段.2、在大体积500mL的2%W/V的碳酸氢钠和1mmol/LEDTA.2NapH=8.0中将透析袋煮沸10min.3、用蒸储水彻底清洗透析袋.4、放在500mL的1mmol/LEDTA.2NapH=8.0中将之煮沸10min.5、冷却后,置于30%或者50%的酒精中,放于4c冰箱,必须保证透析袋始终浸没在溶液内.从此时起取用透析袋必须戴手套.6、在使用前要用蒸储水将透析袋里外加以清洗干净.说明：透析液的配置：10gNaHCO3+186.6mgEDTA.2Na+500mL蒸

11、储水1mmol/LEDTA.2Na:即373.2mg/L方法二：可用沸水煮5至10分钟,再用蒸储水洗净,即可使用.方法三：可先用50%乙醇煮沸1小时,再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和1mmol/LEDTApH=8.0溶液洗涤,最后用蒸储水冲洗即可使用.说明：1 .EDTA煮主要是为了除去生产时附着在透析袋上的金属离子.2 .透析袋的截留分子量3000kd.使用后的透析袋保存方法：1 .用生理盐水浸泡以去掉蛋白,并用蒸储水清洗干净,然后置于50%乙醇中保存即可；2 .用完以后,要彻底洗干净,透析袋也可以保存在0.1%叠氮钠可预防微生物生长里；0.05%-0.1%叠氮钠,或者1mM

12、EDTA,或者50%甘油中4度保存,公司的人建议前两种保存比拟好！3 .使用后的透析袋洗净后可存于4c蒸储水或者30%乙醇中,保证透析袋始终浸没在溶液内.假设长时间不用,可加少量NaN2,以防长菌.从此时起取用透析袋必须戴手套.洗净凉干的透析袋弯折时易裂口,用时必须仔细检查,不漏时方可重复使用.实验操作:1、取空白酶标板,于每孔中参加纯化蛋白溶液封盖酶标板,室温包被过夜.100dL于振荡器上震荡混匀,用封口膜2、取下封口膜,弃去酶标板内溶液,用洗剂液每孔参加1%BSA封闭液100dL37c封闭1h.3、取下封口膜,弃去酶标板内溶液,用洗剂液每孔参加一抗血清100口,37c封闭1h.4、取下封口

13、膜,弃去酶标板内溶液,用洗剂液1xPBST洗剂酶标板1XPBST洗剂酶标板1XPBST洗剂酶标板5次,最后一次吸干.5次,最后一次吸干.5次,最后一次吸干.每孔参加酶标二抗兔抗羊IgG-HRP100dL37c封闭1h.5次,最后一次吸干.5、取下封口膜,弃去酶标板内溶液,用洗剂液1XPBST洗剂酶标板每孔加底物A50d附底物B50M震荡混匀,室温显色1015min.6、每孔参加终止液50科,马上在酶标仪450nm波长下读取OD值.加样孔OD值检测血清其他血清阴性血清或未免血清只加稀释液或未免血清、酶标二抗,底物显色液A、B及终止液酶空白孔只加酶标二抗,底物显色液A、B及终止液底物空白孔只加底物

14、显色液A、B及终止液纯空白孔只加终止液抗血清的纯化Purificationofantiserum抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分,以预防抗体外的其他血清成分对试验结果产生影响.因此只能根据不同目的的要求,从抗血清中除去容易干扰的有关成分,或提取相应的免疫球蛋白.抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程.粗提法主要常用硫酸镂盐析法,精制法分非特异性和特异性两种类型.非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法,其方法均系基于蛋白质分子的物理性质.特异性方法如免疫吸附法,其方法基于抗原抗体的特异性反响.一、盐析法Saltfractionation【实验原理】蛋白质在不

15、同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀,而白蛋白那么不易沉淀,据此可将二者别离.【主要试剂与器材】1 .饱和硫酸镂溶液取500ml蒸储水加热至7080C,将400g硫酸镂溶于其中,搅拌20min,冷却.待硫酸镂结晶沉于瓶底,其上清即为饱和硫酸镂.在使用前用28%氨水调pH7.0.2 .兔血清含抗体.3 .透析袋、离心机等.【操作方法】1.用55%饱和硫酸镂提取血清中就丫球蛋白血清1份加生理盐水1份混匀,然后逐滴参加饱和硫酸镂2份中,边加边搅拌,预防形成团块降消沉淀物的特异性.混匀后静置30min或置4c冰箱过夜.低温高速10000/min离心10min,将上清液

16、含白蛋白弃去,取沉淀物含球蛋白溶于少量生理盐水中.2用33%饱和硫酸镂提取丫球蛋白将上述提取物生理盐水溶液2份加1份饱和硫酸镂.然后再10000/min离心,其余操作同上.3 .按同样方法用33%饱和硫酸镂再提取1次.4 .将提取物装入透析袋,在生理盐水中透析,以除去其中所含的硫酸镂.放-20C冰箱保存.【结果判断】用双向免疫扩散法和免疫电泳法检测抗体活性、效价和纯度.【考前须知】1 .用于盐析的中性盐有硫酸镂、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸盐等,最常用的是硫酸镂,由于硫酸镂饱和溶液所含盐浓度很高,溶解度受温度影响小,一般不引起蛋白质变性,但不纯的硫酸镂含重金属,会影响蛋白质生物活性,故应用分析

17、纯试剂.2 .中性盐浓度不同浓度硫酸镂,当到达20%饱和度时,可沉淀血浆中纤维蛋白原,增加饱和度至28%33%,可使优球蛋白析出,当饱和度大于50%那么可析出白蛋白.3 .pH当溶液pH调至蛋白质的等电点,使所带阳电荷与阴电荷相等时,易使蛋白析出.球蛋白等电点为pH58.4 .蛋白质浓度如血清蛋白的浓度自0.5%递增至3%时,所需中性盐饱和度的最低极限度可从29%递减至24%,但当蛋白质浓度增高后,蛋白质的共沉作用也增加,影响蛋白质纯化,故当溶液内蛋白质浓度过高,可做适当稀释,一般认为2.5%3.0%的蛋白浓度较好.5 .温度盐析蛋白时温度要求并不严格,一般在室温25C比在0c时更易析出,除非

18、盐析对温度敏感的蛋白质如抗体要求在4c进行.6 .透析除盐透析液内NH4+的检测可用纳氏试剂,如产生黄色沉淀证实NH4+的存在.【应用与评价】经盐析法提取的蛋白质为粗提的免疫球蛋白,假设要获得纯化的免疫球蛋白,必须经凝胶过滤或离子交换层析提纯.【思考题】1 .盐析法粗提免疫球蛋白的原理是什么？2 .盐析法粗提免疫球蛋白有哪些考前须知？二、凝胶过滤法Gelfiltration【实验原理】利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶做为介质,可别离提纯分子量不同的大分子物质.在凝胶过滤过程中,分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间空隙先流出凝胶柱外；分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞,流速缓慢而最

19、后流出柱外,这样就能将分子量不同的物质别离.【主要试剂与器材】1.待提纯样品.2.SephadexG-200.3.2.5便0mm层析柱.4.洗脱液0.01mol/LpH7.27.4PBS含0.14mol/LNaCl.5.751紫外分光光度计.【操作方法】1 .处理凝胶将SephadexG-200用蒸储水竟充分膨胀后进行浮选.2 .装柱在层析柱底部铺加一层尼龙纱,然后将洗脱液和凝胶粒子沿插入柱底的玻璃棒缓缓倾注于层析柱内.3 .加样在凝胶柱外表再加一层尼龙纱,沿管壁缓缓参加样品,所加样品体积不超过凝胶柱的10%.4 .洗脱洗脱液洗脱,流速20ml/h.待样品洗脱下来用20%磺基水杨酸检测即用试管

20、分段收集.5 .检测在紫外分光光度计上测定各管样品的A280nm值.【结果判断】以A280nm值为纵轴,收集管次序为横轴,绘出各洗脱峰,并分别收集各峰的洗脱液,再分别进行蛋白质定量与性质和纯度的鉴定.用标准抗体,采用双向琼脂扩散试验、免疫电泳法鉴定蛋白质性质和纯度.【考前须知】1 .膨胀凝胶时,需将凝胶干粉慢慢参加到盛有10倍水的烧杯内,边加边用玻璃棒轻轻搅动,待被浸泡膨胀的凝胶粒沉下,倾去上层水份及内含的细颗粒,换蒸储水数次,浸泡过程搅动要温和轻慢,以免损坏凝胶颗粒,装柱前一定要到达充分膨胀并换洗脱缓冲液PBS再平衡,换PBS23次,待装柱用.2 .一般常用的洗脱缓冲液pH和离子强度以能使样

21、品稳定为原那么.血清蛋白成分的别离纯化,多采用pH6.98.0之间磷酸盐缓冲液或pH8.0Tris-HCl缓冲液.3 .样品洗脱结束后,凝胶即已再生.依次装柱可反复使用屡次.凝胶悬液加防腐剂后于4C冰箱内可保存数月.【应用与评价】凝胶过滤法广泛应用于生物高分子的蛋白质、酶、核算等的别离和提纯；凝胶过滤法还可用来测定蛋白质分子量,需取分子量样品作为标准对照；血清中存在异常免疫球蛋白,经凝胶过滤得到与正常人不同的峰形.【思考题】凝胶过滤法纯化抗体的原理是什么？三、离子交换层析法Ionexchangechromatography【实验原理】离子交换层析是从血清包括抗血清中别离纯化IgG的重要方法.它

22、是利用带电离子的纤维素如DEAE纤维素,吸附带相反电荷的蛋白质,又因各种蛋白质的等电点不尽相同,在一定pH条件下,所带电荷量不等,与纤维素结合的水平有别.当用pH7.4磷酸缓冲液PB洗脱时,人血清蛋白中IgG所带电荷最少,与纤维素结合最差,故最先被洗脱下来,从而可到达别离纯化目的.【主要试剂与器材】1 .蒸储水、0.5mol/LNaOH、0.01mol/LpH7.4PBS、20%三氯醋酸.2 .混合正常人血清、DEAE纤维素.3 .层析柱、烧杯、pH试纸.【操作方法】1 .用蒸储水浸泡适量DEAE纤维素过夜,除去飘浮物,再用0.5mol/LNaOH浸泡30min,反复用蒸储水洗,可用2000r

23、/min离心或布氏漏斗抽滤别离,直到洗至约pH7.4,用0.01mol/LpH7.4PBS再洗一次后装柱.2 .用相同的PBS平衡至pH7.4,当柱上端的PB液凹面与纤维素相切时,参加一定量的血清,待血清渗入柱内与柱面相切时,立即沿管壁加少量洗脱液至形成1cm液层后,用0.01mol/LPBS洗脱,限制流速为1ml/min.3 .分管收集,每管吸取少量洗脱液,加20%三氯醋酸测蛋白,合并、保存蛋白含量较高的洗脱液.4 .将含IgG的洗脱液装入透析袋内,用蔗糖或大分子聚乙二醇包埋过夜,水份析出,袋内IgG被浓缩.IgG可短期保存于4c冰箱中备用.【结果判断】用单向免疫扩散试验测定浓缩液IgG含量,用抗人全血清作免疫电泳测定纯度,如纯化成功,应只在IgG部位出现沉淀线.【考前须知】1 .纤维素装柱时,不能出现断层、气泡,柱面要平整.2 .缓冲液平衡要充分.3 .加血清量不宜过多.【应用与评价】该方法是目前最广泛应用的高分子物质提纯方法之一.总IgG或特异性IgG均可用