SREBP2-STARD4在邻苯二甲酸单丁酯促进胆固醇酯合成中的作用

1、SREBP2-STARD4在邻苯二甲酸单丁酯促进胆固醇酯合成中的作用邻苯二甲酸酯（ phthalate acid ester,PAEs）是一类人造多功能化学品,用于各种消费品和工业产品。 由于 PAEs在产品中为非共价结合 , 因此随着时间的推移 ,PAEs 可以从产品中浸出、 迁移 , 通过摄入、吸入、皮肤接触进入人体。 PAEs对生物体具有致癌 , 致畸和致突变作用 , 对生殖发育和神经系统也有毒性作用。邻苯二甲酸二丁酯 （DBP）是最常用的邻苯二甲酸酯之一, 在体内的代谢产物为邻苯二甲酸单丁酯（ MBP）。本课题组前期研究发现,10-7M MBP暴露可以增加小鼠睾丸间质肿瘤细胞（MLTC

2、-1细胞）孕酮合成水平。在类固醇生成细胞中 , 胆固醇是合成孕酮的前体, 来自于以脂滴形式存储的胆固醇酯的水解。对于 MBP是否可以影响胆固醇酯合成, 尚未有研究。在本研究中我们用MLTC-1细胞研究 SREBP2-STARD4途径是否参与了 MBP促进胆固醇酯合成的过程。目的 :1 、探讨邻苯二甲酸单丁酯（MBP）对胆固醇酯合成的影响2、探讨类固醇激素合成急性调节蛋白4（ STARD4）在 MBP促进胆固醇酯合成中的作用方法:1 、MBP(10-8-10-5M) 处理小鼠睾丸间质细胞（MLTC-1）,酶标法测细胞内胆固醇酯含量。2、ORO法观察 MLTC-1细胞内胆固醇酯的分布。3、qRT-

3、PCR法测定 STARD4和 SREBP2 mRNA表达。 4、Western Blot 法测定 STARD4和 SREBP2的蛋白表达。5、免疫荧光细胞化学法观察 MLTC-1细胞内 STARD4表达变化。 6、应用 RNAi技术下调 STARD4的表达 , 再用 MBP(10-7M)处理 MLTC-1细胞 , 观察MLTC-1细胞内胆固醇酯含量。 7、应用 RNAi技术下调 SREBP2表达 , 再用MBP(10-7M)处理 MLTC-1细胞 , 观察 MLTC-1细胞内 STARD4蛋白表达水平和细胞内游离胆固醇含量。8、双荧光素酶标记法检测SREBP2与 STARD4启动子区域结合活力

4、。结果 :1 、MBP促进 MLTC-1细胞中胆固醇酯的合成MLTC-1细胞暴露于10-8-10-5M MBP后 ,10-7M MBP剂量下发现细胞内胆固醇酯含量相比对照组明显增加（p<0.05）,ORO染色发现 , 脂质染色相比对照组明显加深。2、 STARD4在 MBP促进 MLTC-1细胞胆固醇酯合成中的作用 qRT-PCR和 Western Blot结果表明 ,10-7M MBP 处理后 ,MLTC-1细胞 STARD4 mRNA和蛋白水平与对照组相比均上升（p<0.05）。免疫荧光细胞化学染色联合激光共聚焦法结果显示,10-7M MBP处理后 ,STARD4在内质网上聚集

5、增多。 RNAi实验结果发现 ,STARD4表达水平与细胞内胆固醇酯水平相关 , 且再用 10-7M MBP处理 MLTC-1细胞后 ,STARD4蛋白表达上升 , 细胞内胆固醇酯合成增加（p<0.05）。 3、 MBP对SREBP2基因表达的影响qRT-PCR和 Western Blot实验结果发现 ,MBP可促进SREBP2mRNA和蛋白表达水平升高。采用 RNAi技术抑制 SREBP2表达后 ,MLTC-1 细胞中 STARD4蛋白表达下降 , 再用 MBP(10-7M)处理 MLTC-1细胞 ,SREBP2蛋白表达水平回复（ p<0.05 ）。 4、MBP通过 SREBP2-STARD4促进胆固醇酯合成采用 RNAi抑制SREBP2表达后 ,MLTC-1细胞中 STARD4蛋白表达下降 , 细胞内游离胆固醇含量增加。再用 MBP（ 10-7M）处理 MLTC-1细胞 ,SREBP2和 STARD4蛋白表达水平回复 , 细胞内游离胆固醇含量降低（p<0.05）。采用双荧光素酶标记实验发现,SREBP2可与 STARD4启动子区域结合 , 且MBP(10-