转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞,使

1、n转化转化(Transformation)(Transformation)是将外源是将外源DNADNA分子引入受体细胞分子引入受体细胞, ,使之获得新的遗传性状的一种手段使之获得新的遗传性状的一种手段, ,它是微生物遗传、分它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 n受体细胞经过一些特殊方法受体细胞经过一些特殊方法( (如电击法如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl,CaCl2 ,RbCl(KCl) )等化学试剂法等化学试剂法) )的处理后的处理后, ,细胞膜的通透性发生了暂时性细胞膜的通透性发生了暂时性的改变的改变, ,成为能允

2、许外源成为能允许外源DNADNA分子进入的分子进入的感受态细胞感受态细胞(Competent cells)(Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子中培养，即可筛选出转化子(Transformant(Transformant, ,即带有异源即带有异源DNADNA分子的受体细胞分子的受体细胞) )。一、实验原理一、实验原理n所谓感受态，所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。就是细菌吸收转化因子的生理状态。n关于感受态的本质与存在，说法很多，关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两目前主要有两种假说：种

3、假说： 局部原生质体化假说感受态细胞的局部原生质体化假说感受态细胞的表面形成一种能接受的酶位点，表面形成一种能接受的酶位点， 使分子使分子能进入细胞。能进入细胞。1 1、感受态细胞的制备、感受态细胞的制备CaCl2CaCl2法是以法是以MendelMendel和和HigaHiga（19701970）的发现为基础，）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于其基本原理是：细胞处于 0 0 4 4 ， CaCl2 CaCl2 低渗溶液低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA DNA 形成抗形成抗 DNA DNA 酶的羟基酶的羟基 - - 钙磷酸

4、复合物粘附于细钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经胞表面，经 42 90 42 90 秒热激处理，促进细胞吸收秒热激处理，促进细胞吸收 DNA DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（苄青霉素耐药（ Amp r Amp r ）得到表达，然后将此细菌培）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含养物涂在含 Amp Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。即可获得细菌菌落。（一）（一）CaClCaCl2 2 转

5、化法转化法核心：目标细胞在核心：目标细胞在 CaClCaCl2 2H H2 2O O 溶液中浸泡一段时间，溶液中浸泡一段时间， 转化效率转化效率 10107 7-10-109 9 cell/ cell/gDgD 。 NE.coli NE.coli: DH5: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105, TG1, XL-1Blue, JM105 （1 1）冰上）冰上 30min 30min （2 2）热激）热激 42 90“42 90“ （3 3）恢复）恢复 1 12min2min （4 4）复苏）复苏 37 45-60 min37 45-60 min（二）原生质体转化法（二）原生质体

6、转化法（protoplastprotoplast）适用于适用于 G G+ + 细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。过程：过程： （1 1）等渗环境下，脱细胞壁（）等渗环境下，脱细胞壁（LysozymeLysozyme） （2 2）细胞壁再生）细胞壁再生（三）电转化法（三）电转化法（electroporationelectroporation）缓冲液：缓冲液：10% 10% 甘油或蔗糖，含（或不含）甘油或蔗糖，含（或不含） MgMg2+ 2+ 离子。离子。转化条件：转化条件：2.5 KV/0.2cm 252.5 KV/0.2cm 25F 200-400F 200-400。n分

7、子转化分以下几步分子转化分以下几步: : 吸附吸附双链分子吸附于受体菌表面；双链分子吸附于受体菌表面； 转入转入双链分子解链。一条链进入双链分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；受体菌，另一条降解； 自稳自稳外源质粒分子在细胞内复制外源质粒分子在细胞内复制成双链；成双链； 表达表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。转录翻译。2.2.转化转化n这和受体菌：质粒的选择相关，这和受体菌：质粒的选择相关， 原则上要注意：原则上要注意：n受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株；受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株；n 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则

8、而定。根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。n重组子的筛选方法常用的有两种方法：重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法抗生素筛选法 互补法互补法3.3.重组子的筛选重组子的筛选n 菌株为某种抗生缺陷型，菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。才能在含该抗生素的培养基上长出。n本实验利用抗生筛选转化子。本实验利用抗生筛选转化子。抗生素筛选法抗生素筛选法n现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌

9、的短区段，其中含有肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酸基半乳糖苷酸基因（因（lacZlacZ）的调控序列和头个氨基酸偏码区。）的调控序列和头个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。这个偏码区中插入一个多克隆位点。n 受体菌则含编码受体菌则含编码半乳糖苷酶端的序列。当半乳糖苷酶端的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有外源基因插入时，二者溶为一体后，有半乳糖苷半乳糖苷酶表达，酶表达， 在生色底物溴氯吲哚在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（半乳糖苷（x-galx-gal）培养基中形成兰色菌落。）培养基中形成兰色菌落。n而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失而当有外源基因插入到多克隆原点，

10、从而造成插入失活，而使活，而使lacZlacZ基因不表达而形成白色菌斑。基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色通过颜色不同而区分重组子和非重组子。不同而区分重组子和非重组子。、互补法、互补法菌种菌种 ：E. coli DH5aE. coli DH5a（空）、（空）、 E. coli K12E. coli K12（空）（空）设备设备 ：eppendorfeppendorf管、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，台式高速离心机， 涡旋振荡涡旋振荡器器试剂试剂：LBLB液体培养基液体培养基 、 0.1mol/L CaCl0.1mo

11、l/L CaCl2 2 、 AmpAmp二、材料、设备及试剂二、材料、设备及试剂 一、感受态细胞的制备一、感受态细胞的制备 （一）、受体菌的培养（一）、受体菌的培养 （二）、感受态细胞的制备（二）、感受态细胞的制备 ( CaCl2 ( CaCl2 法法) ) 1 1、将、将1.5ml1.5ml（每人）培养液转入离心管中（每人）培养液转入离心管中, , 于于44下下3000g3000g离心离心1010分钟。分钟。2 2、弃去上清、弃去上清, ,用预冷的用预冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl2 2 溶液溶液1ml1ml轻轻悬浮细胞轻轻悬浮细胞, ,冰上放置冰上放置15-301

12、5-30分钟后分钟后,4,4下下3000g3000g离心离心1010分钟。分钟。 3 3、弃去上清、弃去上清, ,加入加入200200l预冷的预冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl2 2 溶液溶液, ,轻轻悬浮轻轻悬浮细胞细胞, ,冰上放置几分钟冰上放置几分钟, ,即成感受态细胞悬液。即成感受态细胞悬液。4 4、 感受态细胞分装成感受态细胞分装成200l200l的小份的小份, ,贮存于贮存于-70-70可保存半年。可保存半年。 二、二、 转化转化 1 1、取、取200l200l感受态细胞悬液置冰上。感受态细胞悬液置冰上。2 2、加入、加入1-10ulDNA,1-10ulDN

13、A,轻轻摇匀轻轻摇匀, ,冰上放置冰上放置3030分钟后。分钟后。 3 3、4242水浴中热击水浴中热击2min2min，热击后迅速置于冰上冷却，热击后迅速置于冰上冷却3-53-5分钟。分钟。 4 4、向管中加入、向管中加入1ml LB1ml LB液体培养基液体培养基, ,混匀后混匀后3737振荡培养振荡培养45min-145min-1小时小时。 5 5、将上述菌液摇匀后取、将上述菌液摇匀后取200l 200l 涂布于含涂布于含AmpAmp的筛选平板上的筛选平板上, ,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37,37培养培养16-2416-24小时。小时。 对照

14、：对照： 另取未转化感受态细胞分别涂布另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板（筛选平板（AmpAmp终浓度终浓度50ug/ml50ug/ml）和和空白平板空白平板实验结果：实验结果：下次实验观察并分析筛选结果下次实验观察并分析筛选结果 为了提高转化效率为了提高转化效率, , 实验中要考虑以下几个重要因实验中要考虑以下几个重要因素：素： 1. 1. 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度: : 不要用经过多次转接不要用经过多次转接或储于或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从7070或或-20-20甘甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密

15、度以刚进入对数生长期时为好，菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的可通过监测培养液的OD600 OD600 来控制。来控制。DH5DH5菌菌株的株的OD600 OD600 为为0.50.5时时, ,细胞密度在细胞密度在5 510107 7 个个/ml/ml左左右右( (不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同), ),这时比较合适。密这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。度过高或不足均会影响转化效率。 2. 2. 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度: : 用于转化的质粒用于转化的质粒DNADNA应主要是应主要是超螺旋态超螺旋态DNA(cccDNADNA(ccc

16、DNA) )。转化效率与外源。转化效率与外源DNADNA的浓度的浓度在一定范围内成正比在一定范围内成正比, ,但当加入的外源但当加入的外源DNADNA的量过多或的量过多或体积过大时体积过大时, ,转化效率就会降低。转化效率就会降低。1ng1ng的的cccDNAcccDNA即可使即可使50l 50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA,DNA溶液溶液的体积不应超过感受态细胞体积的的体积不应超过感受态细胞体积的5 5。 3. 3. 试剂的质量试剂的质量: : 所用的试剂所用的试剂, ,如如CaCl2 CaCl2 等均需是等均需是最高纯度的最高纯度的(GR.(G

17、R.或或AR.),AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制, ,最好最好分装保存于干燥的冷暗处。分装保存于干燥的冷暗处。 4. 4. 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNADNA的污染：整个操作过程的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行均应在无菌条件下进行, , 所用器皿所用器皿, , 如离心管如离心管, , tiptip头等最好是新的头等最好是新的, ,并经高压灭菌处理并经高压灭菌处理, ,所有的所有的试剂都要灭菌试剂都要灭菌, ,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNADNA酶或杂酶或杂DNADNA所污染所污染, , 否则均会影响转化效率或否则均会影响转化效率或杂杂DNADNA的转入的转

18、入, , 为以后的筛选、鉴定带来不必为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。要的麻烦。 1. 1.感受态细胞低效感受态细胞低效2.2.抗生素使用错误抗生素使用错误3.3.转化后立即涂板忘转化后立即涂板忘记温浴记温浴1. 1.使用高效率的感受态细胞使用高效率的感受态细胞（10106 6以上）以上）2.2.复查质粒抗性，使用正确复查质粒抗性，使用正确的抗生素的抗生素3.3.转化后温浴转化后温浴45min45min左右，左右，让抗性基因得以表达。让抗性基因得以表达。q问题一：问题一：转化后无克隆产生转化后无克隆产生 原原因因对对策策1. 1.未加未加IPTG/X-GalIPTG/X-Gal或或其失效其失效2.2.抗生素失活，敏感抗生素失活，敏感菌亦能生长菌亦能生长3.3.用于制备感受态的用于制备感受