实时荧光定量PCR原理和实验

1、实时荧光定量 PCR原理和实验陈云地作者单位：200030美国应用生物系统公司（AppliedBiosystems）无论是对遗传病（如地中海贫血和血友病）、传染 病（如肝炎和艾滋病）或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物 对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果， 定量PC敬术都可以发挥很大作用。定量PC时术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCM循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确 定CT值，从而根据CT值确定起始DN砌贝数，做到了真 正意义上的DNAt量。这是DNAt量技术的一次飞跃。根据最终得到的数据不

2、同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同 方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的 结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中 基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量 PC也可以分为 TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两 种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所 得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据 精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计 学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此 重复实验和设立内对照非常重要。

3、由于各种各样的客观原 因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。 当然，与定性实验一样，定量 PCR&要设立阴性和阳性对 照，以监控试剂和实验操作方面可能由现的问题。1为什么终点定量不准确 ？我们都知道理论上 PCR一个指数增长的过程， 但是实际的PCRT增曲线并不是标准的指数曲线，而是 S 形曲线。这是因为随着 PCRB环的增多，扩增规模迅速增 大，Taq酶、dNTR引物，甚至DNA莫板等各种PCR要素逐 渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐 减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCRt进入了平台期。 由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PC阪应体系进入平台期的时

4、机和平台期的高低都有很大变化，难以精 确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DN砌贝数也是完全不一样的， 波动很大（图1） ,图1同一个样本重复96次PCR的扩增曲线传统的定量方法，如澳乙锭染色或放射性核素掺入标记后 的光密度扫描等，测定的都是 PCR的终产物，而不是起始 DN砌贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线 性关系，所以根据最终的 PC矿物量不能计算由起始 DNA 拷贝数。对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效 的监测等，需要测定的都是 PC做大之前标本中的 DNAK 始拷贝数，经过 PCRT增以后的DNA拷贝数已经不能反映 真实情况。在这种情况下，

5、就不能采用终点定量，而要根 据CT值确定DNAg始拷贝的数量。2为什么CT值与起始模板拷贝数成线性关系？CT值的定义是PCRT增过程中，荧光信号开始由 本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。从图1的重复实验中可以直观地看到，尽管平台期DN砌贝数波动很大，CT值却是相对固定的。如果用不同浓度的DNA乍PCR可以看由DNA浓度越高，CT值越小。DNA每增加 1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA勺起始拷贝数成反比这一结论可以从数学上严格证明。为使表达式简便，以下推导忽略 PCR率等细节。如果考虑这些因素， 可以在方程上增加修正项。这些修正项的增加并不改变方 程的线性性质。一般地，我们有

6、 Rn=RB+XO(1+EX)nR他就是说第n次PCR 循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上 每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的 乘积。当循环次数 n = CT时，则有 RT=RB+XO(1+EX)CTRS 两边取对数，得 10g(RT -RB) = logX0 + CTlog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CT1og(1+ Ex) = - 1ogX0 + 1og(RT -RB)-logRs 。c 丁 .g X匕 衣一衣Q - kg .所以对于每一个特定的 PCR&应来说，EX RT RB和RS都 是常数，所以CT值与log X0成反比，也就是

7、说，CT值与 起始模板拷贝数(X0)的对数成反比，起始DNA度每增加1 倍，CT值减小1个循环。根据CT值的定量是精确和严格的， 而传统的终点定量则比较粗放。如果读者有兴趣的话，也可以假设PCR的效率(即Ex)为100%从上式推算由定量 PCR标准曲线的最佳斜率和 CT值的最佳范围。3怎样确定CT值?实验操作中，CT值定义为在基线上方产生可检测 到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR1环次数（图2） o “基线上方”也就是阈值高度的量化定义是基线范围 内荧光信号强度标准偏差的 10倍。阈值所在的横线与 PCR 扩增曲线的交点所指的 PCRB环次数就是CT值。基线范围 的定义是从第3个循环起

8、到CT值前3个循环止，其终点要 根据每次实验的具体数据调整，一般取第3到第15个循环之间。早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校 正信号往往波动比较大，不是真正的基线高度；而在CT值前3个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开始增强， 超过了基线高度，都不宜当作基线来处理。图2 CT值和阈值显然，CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA勺起始拷贝数越多；CT值越大，模板DNA勺起始拷贝数越少。正常的 CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。4荧光信号和定量数据的归一化虽然大多数定量PCR仪都会自动扣除本

9、底，但是 仍然需要注意荧光信号强度和定量数据的归一化校正，以 便不同样本之间的实验数据可以严格地相互比较。由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发 效率的差异等偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始 信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对定量结果的 影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染 料来实现，一般采用红色 RO殴光，称为阳性参比信号。ROX&反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。目标基因 和对照基因的信号除以阳性参比信号以后，即Rn = R /RROX就可以在同样的起点上进行比较和各种计算。RO烟正可以提高定量数据

10、的精度和重现性，减少孔间差异（图 3）。图3 ROX荧光校正（左）和不校正（右）对实验数据的影响归一后的荧光信号再扣除本底，就得到DRn DRn = Rn,样本-Rn,空白。DRn是最后构建PCR实时扩增曲线的纵坐标。无论绝对定量还是相对定量，在得到实验结果后， 还要考虑数据之间的可比性问题。在实验操作中，取样都 是以体积或重量为单位的，但是同样体积或重量的样本所 来源的细胞数目并不一样，所以拷贝/以L或拷贝/ng的定量数据相互之间实际上并不可比。只有将这些数据归一到 以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位后，才可进行严格意义 上的比较。这种校正可以通过适当的参比来完成。参比一般 选用b-actin

11、 、GAPDH rRNA基因等管家基因。由于它们在 细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境 因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因 组的数量。校正方法为：DNA样本/ DNAIPC,或者DCT =CT,样本-CT, IPC 。因为CT值与起始 DN砌贝数的对 数是反比关系，可以证明，这两种计算方法在数学上是等 价的。为了减少误差，目标基因和参比基因最好在同一 反应管内同时进行定量测定，所以这种对照称为阳性内对 照(Internal Positive Control , IPC)。要进行 IPC 归一 化校正，定量PCR仪必须具备多色检测能力，最好是 4色。 否则，目标基

12、因和参比基因只能分两管作定量，就不成其 为“内”标了。5污染的预防和热启动为保证定量的准确性,要预防非特异性PCRT增和污染。常用的措施有使用 UNCW(Uracil-N-Glycosylase) 和热启动。UNG的作用原理是降解含有 dU的双链或单链 DNA它在50 C激活，95 C灭活。由于商用 PCR试剂J盒 均以dUTP取代dTTP,所以PC矿物都是含有 dU的DNAgt， 在定量PCRFF始前增加50 C的保温步骤，UNG1即可将已 有的PC矿物降解破坏，防止可能造成的污染。普通的Taq酶即使在室温下也有一定的活性，如 果不采取措施，在加入 PCR式剂的过程中、正式 PCRFF始 前

13、就会完成少量PCRT增，增加了背景，影响定量精度。 而金牌Taq酶经过特殊修饰，常温下其活性部位被封闭， 没有活性；只有经过 95 C 10 min的热启动以后，封闭 被解除，才能开始 DNAS延伸，这样就最大限度地减少了 杂讯的生成。6标准曲线、重复实验和阴性、阳性对照定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验， 对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小。所以定量 实验的每个样本至少要重复 3次以上，严格的定量更应当 重复68次，以满足小样本统计的要求。如果作绝对定量，则标准曲线需要在5个点以上。标准曲线使用的标准品是浓度已知的DNA羊本，可以自己制备，也可以购买商品化的试剂盒。其PCR&应条

14、件应当与未知样本的一致，以便在同一反应板上同时定量。阴性对照中不加模板 DNA而以水或缓冲液代替， 用于检验是否存在 PCR亏染。阳性对照则用于检验 PCR式 剂和实验操作上可能由现的问题。如果实验中设立了IPC,则IPC既可以用来校正数据，也可以起到阳性对照的作用。7 TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量 PCRi术，其核 心是利用Taq酶的3 -5外切核酸酶活性，切断探针， 产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光 信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PC阪应体系中，包括一 对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其 结合位点在

15、两条引物之间。探针的5端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM VIC等，3端标记有荧光淬灭基 团(Quencher, Q),如TAMR畤。当探针完整的时候，报告 基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信 号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结 合的探针，其3 -5外切核酸酶活性就会将探针切断， 报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光 信号(图4)。所以，每经过一个 PCRf环，荧光信号也和 目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度 就代表了模板DNA勺拷贝数。上话引物TaqMan 探针R)&5,图4 TaqMan探针的荧光信号产生

16、机制TaqMan探针根据其3端标记的荧光淬灭基团的不同分为 两种：普通的 TaqMan探针和TaqManMG解针。MG解针的 淬灭基团采用非荧光淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强 度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder) 修饰基团(图5),可以将探针的 Tm值提高10 C左右。因此 为了获得同样的Tm值，MGEW针可以比普通TaqMan探针设 计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率 大为提高。因为在模板的DNAm基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan

17、 MG陈针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。图 5 TaqMan MGB探针8 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBRGreen I是一种只与DNA链结合的荧光染料（图6）。 当它与DNA链结合时，发生荧光；从DNA链上释放由来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，具信号 强度代表了双链 DN6子的数量。SYBR Green荧光染料法 定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当 SYBR Green染 料与DNA双链结合时发生荧光。 2、DN较性时，SYBRGreen 染料释放由来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PC*物。4、聚合完成后，SYBRGreen

18、染料 与双链产物结合，定量 PCR系统检测到荧光的净增量加大。图6 SYBR Green I荧光染料与 DNA?Ot的结合SYBRGreen I荧光染料能与所有的 DNA链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PC阪应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是 一种成本低廉的选择。9定量PCR仪简介目前在国内使用得比较多的荧光实时定量PCR仪有美国应用生物系统公司 (Applied Biosystems , ABI)的 7000、5700、7900、7700 型和罗氏公司的 LightCycler 等。

19、下面以ABI最新推由的7000型为例作简单介绍。7000型荧光定量PCR仪设计满足临床检验、医学 研究和基础实验的要求，面向低通量至中等通量的用户。随机配置的定量PCR引物和探针设计软件 Primer Express 非常有用，因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定 量PC所需的TaqMan探针。7000型有实时动态(Real-Time)和终点读板 (Plate Read)两种运行模式。实时动态模式用于定量，测 定DNA RN砌贝数。7000型可以动态显示 PCRT增曲线 的生成，定量的线性范围大于7个数量级，区分5000和10000个拷贝的DNA莫板可彳t度达99.7%。终点读板模式用 于

20、基因型鉴定、点突变检测和单核昔酸多态性(SNP分析等。当然，7000型也可以作为普通 PCR仪使用。ABI已经 发布12万个商品化的定量 PCR式剂盒，覆盖人类全部 4万 个基因，平均每个基因3个检测试剂盒，为运用7000、7700、 7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。7000型最大特色是具备多色检测能力，荧光检测 的波长范围为 530590 nm,能够有效地分辨 FAMTM SYBR? Green I、VICTM / JOETM、TAMRATMR ROXT滩荧光染料。 多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一 反应管内同

21、时对多个目标基因进行定量，可以大大提高精 度并节约成本。7000型支持两种定量化学：TaqMan荧光探针和 SYBRGreen I 荧光染料。其熔解曲线(Dissociation Curve) 功能用于判断PCRT增反应是否特异，有无杂带生成。进一步阅读材料 基本方法1 Lie, Y. S. and C. J., Petropoulos. Advances inquantitative PCR technology: 5 nuclease assays.Curr Opin Biotechnol 9: 43-48. 1998.2 Orlando, C., P., Pinzani, and M.,

22、 Pazzagli.Developments in quantitative PCR. Clin ChemLab Med 36: 255-269. 1998.绝对定量3 Becker K., D. Pan and C.B. Whitley. 1999. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther. 10: 2559-2566, 1999.4 de Kok, J.B., Hendriks, J.C., van Solinge, W.W., W川ems, H.L., Mensink, E.J., and Swinkels, D.W. Use of real-time quantitative PCRto compare DNAisolation methods. Clin.Chem. 44(10): 2201-2204, 1998.5 Wang X., X. Li, R.W. Currie, R.N. Willette, F.C.Barone and G.Z. Feuerstein. Application of real-time pol