伪狂犬病检测方法

1、十一、 伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定 1 材料准备DMEM 培养基、BHK-21 细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2 培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录 A（标准的附录）2 操作步骤 2.1 病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4c 送实验室检测。2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME 培养基制成 1:5 孚 1 剂，一 70C 反复冻融后，经 3000rpm 离心 30 分钟后，取上清液经 0.22m 微孔滤膜过滤后，加入青链霉

2、素溶液至最终浓度为 100U/mL,70C 保存作为接种材料。2.3病料接种将病料滤液接种已长成单层的 BHK-21 细胞，接种量为培养基量的10%,37。叵温箱中吸附 1 小时后，加入含 10%新生犊牛血清（经过 56c 水浴灭活 30分钟，过滤除菌，无支原体）的 DMEM 培养基，置 37c 温箱中培养。2.4观察结果接种后 24-48 小时，BHK-21 细胞应出现典型的细胞病变效应（Cytopathogeniceffect,CPE）,表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE,应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无 CPE,则判为伪狂犬病病毒阴性。2.5 病毒的鉴定将出现 CPE 的

3、细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶 K,十二烷基磺酸钠（SDS）,苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN 缓冲液。溶液配制见附录 C（标准的附录）引物：扩增伪狂犬病病毒基因中 434651bp 之间 217bp 基因片段，由上海生物工程公司合成。序歹 U 为，上游引物 P1:5-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3,下游引物P2:5-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR 扩增仪，电泳仪2 操作步骤：1.%21 样品的采集：

4、对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。1样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按 1:5 用 TEN 缓冲液悬浮收集于离心管内，-70C 反复冻融 3 次，7000r/min 离心 5min,如样品为鼻试子，则加入 2mlTEN 缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm,离心 5 分钟，取上清液。取上清液 472.5 仙 l,加入 25 仙 l10%SDS 和 2.5 仙 l 的 20mg/ml 蛋白酶 K,50c 水浴摇床上放置 2h 后加入等量的饱和酚 500 川，涡旋 20s。离心取上清液，加等量的酚：氯

5、仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24:1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20 履双蒸水溶解，-20C 贮存备用。1.PCR 的操作程序先将制备的模板 DN/g100c 水浴 10 分钟作变性处理，然后立即放于冰浴中。 PC 网应体系为： 总体积 25 小， 含有 50m?mol/LKCl,10mmol/LTris-HCl（pH9.0）,0.1%TritonX-100?,?100?mol/LdNTPs,0.35Nmol/L 引物，2mmol/LMgCl2,及 0.5UTaq 酶，1 仙 l 模板 DNA 常用的反应体系组成如下10X 缓冲液 2.5 川15mMM

6、gCl22.5 履dNTPs2.0 仙 l引物各 2.0 履Taq 聚合酶 1.0 川DNA 模板 2.0 仙 l灭菌去离子水 11.0 履矿物油约 20 履扩增条件为：94C 变性 3 分钟，进入循环，94C60 秒，65C60 秒，72C60 秒，40 个循环后 72c 延伸 5 分钟。1PCR 产物的检测 PCR 扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶上电泳，澳化乙锭染色，在紫外光下观察结果。为进一步进行 PCR 扩增产物的特异性鉴定，可取PCR 产物用 Sall 酶切，酶切产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳，EB 染色，在紫外光下观察并与标准分子量比较，可见产生的 140bp 和 77bp 两个片段。

7、伪狂犬病荧光抗体试验1 材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮（分析纯），伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录 D（标准的附录）2 操作步骤2.1 样品采集扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如不能及时送出，必须冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可用于对疑似伪狂犬病病毒的培养物进行鉴定。2.2 切片制备将样品组织块切成 1cmx1cm 的面，不经任何固定处理，直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求 57um 将切片展贴于 0.8mmx1mmj 的洁净载玻片上。2.3 固定：将切片置纯丙酮中固定 15 分钟，取出立即放入 0.01mol/L,pH7.

8、2 的磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗 34 次，取出，自然干燥后尽快进行荧光抗体染色。2.4 染色将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于 37c 作用 30 分钟，取出后放入磷酸盐缓冲液中充分漂洗，再用 0.5moL/L,pH9.09.5 碳酸盐缓冲甘油封固盖片（0.1mm 厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。2.5 观察将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。1.6 判定：于荧光显微镜视野中，见细胞中出现明亮的黄绿色荧光，判为伪狂犬病病毒感染阳性。伪狂犬病微量中和试验（固定病毒，稀释血清法）1 材料准备0.25%胰酶（配制见附录 B）、BHK-21 细胞,多道

9、可调微量移液器，96 孔细胞培养板,CO2 培养箱，倒置显微镜。2 操作步骤1.病毒半数组织细胞感染量（TCID50）的测定：1病毒培养和收获将伪狂犬病毒接种于长成单层的 BHK-21 细胞，接种量为液体培养基量的 10%,37c 培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。1病毒的滴定用 DMEM 培养基将伪狂犬病病毒作连续 10 倍稀释，即 10t、102,每个稀释度取100仙L加入96孔细胞培养板中， 随后加入经0.25%胰酶消化的BHK-21细胞 100NL（细胞含量以 105/mL 左右为宜），每个稀释度作 8 个重复，并设空白细胞培养对照。置 37C5%CO2培养箱中。1TCID50计算逐

10、日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。 按照 Reed-Muench 法计算病毒的 TCID50（具体的计算示例见附录 B）o1.中和试验将无菌采集的待检猪血清置 56c 水浴灭活 30 分钟。用 DMEM培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入 50NL 培养基，随后在第一孔中加入经待检猪血清 50NL 混合后，用微量移液器取出 50 仙 L,加到第二孔中，混匀后取出 50NL 再加入第三孔中，依此类推。血清稀释度即为 1:2、1:4、1:8,每份待检血清稀释度作 2-4 个重复。将 50 仙 L 含 200 个 TCID50的病毒液加入到不同稀释度血清孔中，37c

11、作用 1 小时，每孔中再加入 100NL 经胰酶消化分散的 BHK-21 细胞，同时设病毒对照、阳性血清、阴性血清，待检血清、正常细胞对照。1.计算抗体中和效价逐日观察，直至细胞对照出现老化脱落为止，按Reed-Muench 两氏法，计算抗体中和效价。如抗体效价为 1:2 及 1：2 以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。伪狂犬病酶联免疫吸附试验（间接法）1 材料准备：抗原、酶标抗体，底物（OPDH2O2）,酶联免疫检测仪；溶液配制见附录 F（标准的附录）2 操作步骤：1.包被将 PRV 抗原加入酶标板孔内，每孔 100uL,37c 作用 1h 后置 4c 冰箱过夜。1.洗涤弃去孔内液体，用洗涤液洗

12、3 次，每次 3min,用吸水纸拍干1.封闭各孔加入封闭液 100uL37c 作用 1h。按 2.2 步骤洗涤2.4 加入待检血清待检血清经 56oC30 分钟灭活将待检血清用洗涤液稀释，每孔100uL,37c 作用 1h。重复 2.2 步骤。2.5 加入酶标抗体用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔 100uL,37C 作用 1h。重复 2.2 步骤。2.6 加入底物（OPD-H22）:每孔 100uL,室温避光显色 25 分钟。2.7 终止反应每孔加入 50uL 终止液终止反应。2.8 测定 OD 值在酶联免疫检测仪上 490nm 波长处读数。2.9 血清阴阳性判定标准的确定取 60 份经

13、中和试验检测为 PRV 抗体阴性的猪血泣按1:20 稀释后进行间接 ELISA 试验，测定 490nm 波长处 OD 值，规定以 60 份血清的平均 OD 值加上 3 倍标准差作为判定阴阳性的临界值。伪狂犬病乳胶凝集试验1 材料准备：伪狂犬病乳胶凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液，玻片，溶液配制见附录 E（标准的附录）2 操作步骤：2.1 待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理2.2 将待检血清用稀释液作倍比稀释后，各取 15NL 与等量乳胶凝集抗原在洁净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在 35 分钟内观察结果；可能出现以下几种凝集结果，即：100%凝集：混合液透亮，出现大的凝集块

14、75%凝集：混合液几乎透明，出现大的凝集块50%凝集：约 50%乳胶凝集，凝集颗粒较细25%凝集；混合液浑浊，有少量凝集颗粒0%凝集：混合液浑浊，无凝集颗粒出现如出现 50%凝集程度以上的（含 50%凝集程度），判为伪狂犬病抗体阳性，否则判为抗体阴性。如为阴性，可用微量中和试验进一步检测。伪狂犬病琼脂扩散试验1 材料准备琼脂扩散抗原、阴性血清和阳性血清；优质琼脂粉、平皿2 操作步骤10.8%琼脂板的制作将 1 克琼脂粉溶于 100 毫升 Tris 一盐酸缓冲液（Tris6.5 克，NaCl2.9 克，NaN30.2 克，蒸储水 1000 毫升，用 HCl 调 pH 值至 7.2）中，趁热倾倒于

15、玻璃平皿上，厚度为23mm 待冷却凝集后，打孔，中央一孔，周围 6 孔，孔径为 2mm 周围孔之间距离 2mm 周围孔与中央孔间距为 4mm-6mm 用酒精灯微热封底。2.2 加样将琼脂扩散抗原加到中央孔中，周围孔加经热灭活的待检血清，设阴性血清和阳性血清对照。置温盒 37c 作用，24-48 小时后观察结果。2.3 结果判定在抗原孔与待检血清孔之间出现白色沉淀线，抗体可判为阳性；如待检血清抗体水平较低，可以观察到与待检血清相邻的阳性血清沉淀线末端略向抗原抗弯曲。阴性血清与抗原孔之间则没有沉淀线。伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别乳胶凝集试验.猪伪狂犬病 gG 鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病gG鉴别诊断

16、乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、 全血或乳汁中抗 gG 蛋白的抗体。 用于伪狂犬病毒感染猪与 gG 基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。材料准备：伪狂犬病毒 gG 蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射 gG 基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。1.2 操作步骤1.2.1 对照试验检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立，否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加 gG蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射 gG 基因缺失疫苗血清加 gG 蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射 gG

17、基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。1.2.2 检测试验1.2.2.1 待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理.2.2.2 待检血清一滴，置于玻片上。加 gG 蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动 1-2 分钟，于 3-5 分钟内观察结果（注：gG 蛋白致敏乳胶抗原与血清反应的凝集颗粒较细）；可能出现以下几种凝集结果，即：“+，全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“十”有少许凝集，液体呈混浊；“一”液滴呈原有的均匀乳状。以出现“+”以上凝集者判为阳性凝集。.猪伪狂犬病

18、 gE 鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病 gE 鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒 gE 基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗 gE 蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与 gE 基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。1.1 材料准备：伪狂犬病毒 gE 蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射 gG 基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。1.2 操作步骤1.2.1 对照试验检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立，否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加 gE蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射 gE 基因缺失疫苗血清加 gE

19、蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射 gE 基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。1.2.2 检测试验1.2.2.1 待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1.2.2.2 待检血清一滴，置于玻片上。加 gE 蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动 1-2 分钟，于 3-5 分钟内观察结果（注：gE 蛋白致敏乳胶抗原与血清反应的凝集颗粒较细）；可能出现以下几种凝集结果，即：“+，全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“十”有少许凝集，液体呈混浊；“一”液滴呈原

20、有的均匀乳状。以出现“+”以上凝集者判为阳性凝集。伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别 ELISA.伪狂犬病 gG-ELISA 鉴别诊断（间接法）伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物包被的 ELISA 板用来检测动物血清中抗 gG 蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与 gG基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。1 材料准备：gG 蛋白包被的 ELISA 板、酶标抗体，底物（OPDH2O2）,酶联免疫检测仪；溶液配制见附录 F（标准的附录）1.2 操作步骤：1.2.1 加入待检血清待检血清经 56oC30 分钟灭活后用保温液作 40 倍稀释，每孔加入，37c 作用 30mi

21、n。1.2.2 洗涤弃去孔内液体，每孔用 200uL 洗涤液洗 3 次，每次 3min,用吸水纸拍干。1.2.3 加入酶标抗体用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释， 每孔 100uL,37c 作用 30min,重复 2.2 步骤。1.2.4 加入底物（OPD-H2O2）:每孔 100uL,室温避光显色 25 分钟。1.2.5 终止反应每孔加入 50uL 终止液终止反应。126 测定 OD 值在酶联免疫检测仪上 490nm 波长处读数。测定 490nm 波长处 OD 值，记为 P 值，阴性对照 OD 值记为 N 值，N 值如小于 0.1 时，按 0.1 计算，大于 0.1 时为实际值。当阳性对照孔

22、OD 值一阴性对照 OD 值大于 0.25 时,试验成立。2.7 结果判定：P/N2.1 判为 gG 抗体阳性P/N01.9 判为 gG 抗体阴性，1.9P2.1 判为 gE 抗体阳性P/N01.9 判为 gE 抗体阴性1.9PN2.1,判为可疑伪狂犬病病毒血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验方法（一）红血球的制备：将小白鼠尾尖剪断，插入盛有灭菌的阿氏液的离心管的抽气瓶中，负压抽吸，采血完毕后，将离心管取出，用 PBS 洗涤 3 次，每次 1500 转/分钟离心 10 分钟，使用时加 PBS 配成 0.1%的红血球悬液。（二）待测血清的预处理：取待测血清 0.1 毫升加 PBS0.3 毫升，56

23、c 灭活 30 分钟， 加入 0.4 毫升 25%白陶土 25c 振荡 1 小时， 离心取上清液加入 0.1 毫升配好的 0.1%红血球悬液 37c 作用 1 小时，离心除去红血球，上清液作为 1:8 稀释的血清用于 HI 试验.（三）HA 试验操作：选用 96 孔 V 型板每孔加入 PBS50 微升,在第一排孔的前 6孔内加入 50 微升 PrV 病毒液， 后两孔作为空白对照， 用微量加样器作倍比稀释， 从 1:2至 1:1024，即将第一排孔病毒液混匀后吸出 50 微升至第二排孔均匀混合，再从第二排孔吸出 50 微升至第三排孔，依次类推至最后一排孔取 50 微升弃掉,每孔加入 50 微升0

24、.1%的红血球，在振荡器较微振荡混合均匀，以一定的温度作用 2 小时，观察结果，以完全凝集红血球的最大稀释倍数作为一个血凝单位。（四）HI 试验操作：在 96 孔 V 型板中每孔加入 50 微升 PBS 液，然后在第一排孔的前 6孔内加入 50微升已处理的血清作为对照， 用微量加样器将血清倍比稀释从 1:2至 1:1024,然后各孔加入 50 微升用 PBS 稀释女？的 4 个血凝单位的病毒液，每孔分别加入 50 微升 0.1%红血球悬液，混合均匀后室温放置 2 小时，观察结果。（吴斌何启盖）进口伪狂犬病抗体检测试剂盒（用于普查）一、试剂贮存在 2-7C.PRV 包被酶标板 5 块.抗猪辣根过

25、氧化物酶（HRP 连结物（酶标抗体）60mlPRV 阳性对照血清 4mlPRV 阴性对照血清 4ml样品稀释液 175ml洗涤液（10）250mlTMB 底物 60ml终止液 60ml二、样品的准备用样品稀释液按 1:20 稀释待检血清。（如 20ul 样品加 380ul 样品稀释液）。注意：阴、阳性对照不稀释。每一样品必须更换吸嘴，并记录样品在板上的位置，在样品加到酶标孔内之前必须混合均匀。三、洗涤液的准备浓缩洗涤液（10 x）应置室温并摇动使沉淀的盐能充分溶解。在用之前，浓缩洗涤液（10，）应用蒸储水或去离子水接 1:10 稀释（如 30ml 浓缩洗涤液加 270ml 蒸储水或去离子水即可

26、用于一块板的洗涤）。四、试验过程在使用之前所有试剂必须置室温并轻轻摇动或涡旋。.取出酶标板并记录样品在板上的位置。.在 A1、A2、A3 孔内各加未稀释的阴性对照 100ul。.在 A4、A5、A6 孔内各加未稀释的阳性对照 100ul。.力口 100ul 已稀释的样品（1:20）到相应的孔内，每一样品应同时做 2 孔。.室温作用 30 分钟。.倾去孔内液体到废液缸内。.每孔用近 300ul 的洗涤液洗 3-5 次，每次洗后倾去孔内的液体。在加酶标抗体之前应避免孔内干燥，最后一次洗涤后应在吸水材料上拍干酶标板。.在每一孔内加入 100ul 抗猪的酶标抗体。.室温作用 30 分钟。.重复步骤 6

27、 和 7。.在每一孔内加入 TMB 底物溶液 100ul。.室温显色 15 分钟。.每一孔内加入 100ul 终止剂以终止反应。.空气调零。.在 650nm 测量并记录样品和对照的吸收值。.计算结果。五、结果阳性对照的平均值（PCX）与阴性对照的平均值（NCX）之差（P-N）大于或等于 0.15 时试验方成立。而且阴性对照平均值（NCX）必须小于或等于 0.15。如果试验不成立，可能操作有误，试验应在熟悉产品说明书后重试。每一样品内针对 PRV 抗体的有无是由样品与阳性对照的比率（S/P）来确定。阳性对照已标准化且有很高水平的 PRV 抗体。六、结果的说明S/P 比值小于 0.4 的样品确定为

28、 PRV 抗体阴性。S/P 比值大于或等于 0.4 的样品确定为 PRV 抗体阳性。在该试验中定为阳性的样品应再用“伪狂犬病抗体确认试剂盒”来进一步证明其阳性的真假。七、计算1.阴性对照平均值（NCX）的计算AIA（650）+A2A（650）+A3A（650）0.06+0.063+0.069NCX=例如：=0.064332.阳性对照平均值(PCX)的计算A4A(650)+A5A(650)+A6A(650)NCX=0.313+0.299+0.33例如：=0.314例如：某样品平均值=0.3500.350-640.286S/P=1.140.314-0.0640.250（华中农大覃雅丽、唐勇译）伪狂犬病gE抗体试剂盒（进口）一、试剂贮存在 2-7CPRV 包被酶标板 6 块抗 PRV-gE 辣根过氧化物酶（HRP 连结物（酶标抗体）60ml阴性猪血清对照-不与 PRV-gE 反应的猪血清 5ml阳性对照血清-抗 PRV-gE5ml样品稀释液 120ml洗涤?夜（10，）235mlTMB 底物 60ml8.终止液 60ml二、样品的准备用样品稀释液按 1:2 的比例稀释待检血清。每一样品必须更换吸嘴，样品加到酶标孔内之前必须混合均匀。三、洗涤液的准备浓缩洗涤液（10X）应平衡到室温，摇动使沉淀的盐能充分溶解