口服液体药用塑料瓶微生物污染状况分析及试验方法改进

1、药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1101 药品直接接触包装材料 ( 容器) 是药 品 不 可 或缺的组成局部，伴随着药品生产、流通及使用的全过 程，亦是对药品质量进行评价的一项重要指标1 2。 国家食品药品监督管理局于 2002 2004 年先后颁 布实施了 六 册 共 48 个品种的药品包装材料标准 ( 药包材) 、25 个有关检测方法及一个指导原那么，其 中对直接接触药品、不洗即用且无后续灭菌工艺的药 包材规定了微生物限度或无菌检查项3 5。口服液 体药用塑料瓶直接接触液体药品，其微生物污染势必 会影响药品质量，甚至影响患者的用药平安。因此本 实验

2、以口服液体药用塑料瓶为实验对象进行微生物 限度检查，分析污染状况，以控制其在生产，流通及使 用过程中的可能产生的污染因素，保证药品质量。2方法参照国家药品包装容器 ( 材 料) 标 准 ( 试 行)YBB000920024、2021 年版中国药典二部微生物限度检查法6及美国药典 36 版7进行实验，简述如下。2. 1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30 35 培养 18 24 h; 接种白色念珠菌的新 鲜培养物至改进马丁培养基中，23 28 培养 24 48 h。上述培养物用 0. 9% 的无菌氯化钠溶液制成 每 1 mL 含菌

3、数为 50 100 cfu3的菌悬液。接种黑 曲霉的新鲜培养物至改进马丁琼脂培养基中，23 28 培养 5 7 d，参加 0. 9% 的无菌氯化钠溶液3 5 mL，将孢 子 洗 脱。吸 出 孢 子悬液至无菌试管内，用 0. 9% 的无菌氯化钠溶液制成每 1 mL 含孢子数1仪器与材料WJ 6 无 菌 检 查 仪 ( 天 津市罗根科技有限公 5司) ，一次性薄膜过滤器( 规格: NS01 75D2 ; 批号:20211128; 孔径: 0 45 m; 材质: 尼龙膜) ，生化培养箱( 德国 Binder 公司) ，Phoenix 100 型全自动细菌鉴 定试验系统( 美国 BD 公司) ，Cry

4、stal Spec 型比浊仪( 美国 BD 公司) 。2021 年全国评价性抽验中得到的 4 个品 种、9 种规格、43 家企业的 55 批样品，其中口服液体药用 聚酯瓶( 20、30、40、60、100、120、150、180、200 mL 瓶 1 ) 31 批; 口服液体药用高密度聚乙烯瓶( 10、20、60、100、200 mL瓶 1 ) 17 批; 口服液体药用聚丙烯 瓶( 10、30、100 mL瓶 1 ) 5 批; 口服液体药用聚丙 烯易折瓶( 10、100 mL瓶 1 ) 2 批。培养基: 胰酪大豆胨琼脂、胆盐乳糖增菌液、玫瑰 红钠琼脂、营养琼脂、营养肉汤、改进马丁、改进马丁 琼

5、脂的批号分别为 120730、1204192、1205072、110503、120626、110524、120213，北京三药科技开发，灵敏度实验符合 2021 年版中国药典规定6。为 50 100 cfu 的孢子悬液。供试液制备取供试品 16 瓶，照微生物限度检查法( 中国药 典 2021 年版二部附录J) 6，加 0. 9% 无菌氯化钠 溶液至 1 /2 标示容量，将盖旋紧，振摇 1 min，取全部 提取液，备用。2. 22. 3细菌、霉菌和酵母菌计数检查验证试验薄膜过滤法: 分别量取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌大肠埃希菌和白色念珠菌的菌悬液，黑曲霉孢子悬液 1 mL，加 0. 9% 的无

6、菌氯化钠溶液分别稀 释至 10 mL 作为验证菌备用。取 1 瓶提取液，全量 通过滤膜后，参加验证菌，滤过，将滤膜贴至营养琼 脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上，细菌置 35 培养 24 48 h; 霉菌和酵母菌置 25 培养 48 72 h，观察结果。2. 4细菌、霉菌和酵母菌计数检查试验薄膜过滤法: 取 16 瓶提取液，分别全量通过滤膜枯 草 芽 孢 杆 菌 ( Bacillussubtilis) CMCC后，将滤膜分别贴至 8 个营养琼脂琼脂培养基平板和8 个玫瑰红钠琼脂培养基平板上，细菌置 35 培养72 h; 霉菌和酵母菌置 25 培养 5 d，观察结果。B63501、金 黄 色 葡

7、 萄 球 菌 ( Staphylococcusaureus )CMCC B 26003 、铜 绿 假 单 胞 菌 ( Pseudomonasaeruginosa) CMCC( F)10104、大肠埃希菌( Esche-2. 5需氧菌总数计数检查验证试验薄膜过滤法: 分别量取金黄色葡萄球菌、铜绿假richia coli) CMCC B 44102、白色念珠菌 ( Candi-da albicans) CMCC F 98001，中国医学细菌保藏 中心; 黑曲霉( Aspergillus niger) CMCC F 98003， 中国食品药品检定研究院。试剂: 鉴定培养液、革兰氏阳性细菌鉴定 / 药

8、敏 板、革 兰 氏 阴 性 细 菌 鉴 定 / 药敏板的批号分别为 2107002、2046476、2088399，碧迪医疗器械上海有限 公司。单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌菌悬液，黑曲霉孢子悬液 1 mL，加 0. 9% 的无菌氯化钠溶液分别稀释 至 10 mL 作为验证菌备用。取 1 瓶提取液，全量通过 滤膜后，参加验证菌，滤过，将滤膜贴至胰酪大豆胨琼 脂培养基平板上，30 35 培养 5 d，观察结果。2. 6控制菌检查验证实验取 8 瓶 提 取 液，全 量 通 过 滤 膜 后，将 滤 膜 加 至药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1102 100

9、 mL 胆盐乳糖增菌液，再参加含菌数为 50 100cfu 的大肠埃希菌悬液，30 35 培养 24 48 h，观 察结果。2. 7 需氧菌总数计数检查试验薄膜过滤法: 取 8 瓶提取液，分别全量通过滤膜 后，将滤膜分别贴至 8 个胰酪大豆胨琼脂培养基平 板上，30 35 培养 5 d，观察结果。2. 8 控制菌检查实验取 8 瓶 提 取 液，全 量 通 过 滤 膜 后，将 滤 膜 加 至100 mL 胆盐乳糖增菌液，30 35 培养 24 48 h，观察结果。2. 9污染菌株分析 使用无菌棉签挑取从口服液体药用塑料瓶中分离的污染菌落至鉴定培养液中，混匀，使用比浊仪调 节菌液浓度在 0. 5

10、0. 6 McF 范围内。将菌液倒入 药敏板，将药敏板放入全自动细菌鉴定试验系统进 行菌株分析。33. 1结果与讨论微生物限度检查法的建立 根据国家药品包装容器 ( 材料) 标准 ( 试行) 规定，口服液体药用塑料瓶的细菌、霉菌和酵母菌数:每瓶 不 得 过 100 cfu; 每 1 瓶 不 得 检 出 大 肠 埃 希 菌4。按照 2021 年版中国药典二部微生物限度检 查法6以及 美 国 药 典 36 版采用薄膜过滤法结合 2021 年版中国药典中规定的常用验证菌株6 7这 2 种微生物限度检查方法，对口服液体药用塑料瓶进 行细菌、霉菌和酵母菌、需氧菌总数检查以及控制菌 检查的验证试验。采用薄

11、膜过滤法时，以上 2 种微生物限度检查 方法的 5 株验证菌的 3 次回收率均为 70% 以上( 采 用 2021 年版中国药典检查方法的试验结果见表 1， 采用美国药典 36 版检查方法的试验结果见表 2 ) ， 证明了方法的有效性。表 1 口服液体药用塑料瓶微生物限度检查验证试验结果( 中国药典 2021 年版薄膜过滤法)Tab 1esults of validation test for microbial limit test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in ChP 2021)阳性菌平

12、均回收率( average recovery of positive strains) / %样品( sample)供试品组( test group )大肠埃希菌( E coli)枯草芽孢杆菌( B subtilis)金黄色葡萄球菌( S aureus)白色念珠菌( C. albicans)黑曲霉( A. niger)口服液体药用聚酯瓶( medicinal polyester bottle for oral liquid)098979799100口服液体药用高密度聚乙烯瓶( medicinal polypropylene bottle for oral liquid)099969598100

13、口服液体药用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottlefor oral liquid)09695979398口服液体药用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bottle fo oral liquid)010098999799服液体药用塑料瓶进行了微生物限度检查，污染菌数均未超过 7 cfu瓶 1 ( 表 3、4) ，其中采用 2021 年 版中国药典中规定的细菌计数方法未检出污染微生物为 34 批，占 62% ( 表 3) ，其中所有样品均未检出 污染霉菌和酵母菌; 采用美国药典 36 版规定的需氧 菌总数计

14、数方法未检出污染微生物为 32 批，占58% ( 表 4) 。所有样品分别采用以上 2 种微生物限度检查方法均未检出大肠埃希菌。结合细菌、霉菌和酵母菌计数以及需氧菌总数计数的验证试验结果，进行控制菌检查的验证实验。当采用薄膜过滤法，能满足控制菌检查的根本要求。3. 2口服液体药用塑料瓶微生物限度检查结果 按照建立的口服液体药用塑料瓶微生物限度检查方法和微生物限度检查标准，采用细菌、霉菌和酵 母菌计数以及需氧菌总数计数这 2 种微生物限度检 查方法对 4 个品种、9 种规格、43 家企业共 55 批口药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1103 表 2 口服

15、液体药用塑料瓶微生物限度检查验证试验结果( 美国药典 36 版薄膜过滤法)Tab 2esults of validation test for microbial limit test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in USP 36)阳性菌平均回收率( average recovery of positive strains) / %样品( sample)供试品组( test group )大肠埃希菌( E coli)枯草芽孢杆菌( B subtilis)金黄色葡萄球菌( S aureus)白色

16、念珠菌( C. albicans)黑曲霉( A. niger)口服液体药用聚酯瓶( medicinal polyester bottles for oral liquid)0999998100100口服液体药用高密度聚乙烯瓶( medicinal polypropylene bottles of oral liquid)099979698100版口服液体药用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottles for oral liquid)09898999799口服液体药用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bot

17、tles for oral liquid)010098999799表 3 口服液体药用塑料瓶微生物限度检查结果( 中国药典 2021 年版薄膜过滤法)Tab 3 esults of microbial limit test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in ChP 2021)细菌数( bacterial count) / cfu per bottle样品( sample)批号( batch No )1#2#3#4#5#6#7#8#130501130220130401130201121222130

18、3046130113130411110101151431361212111232011114222221661022014401000472023014001000660020004000000273040000000000050040000000000000050000口服液体药用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bottles for oral liquid)2021040120210204130402202103012021040820210309202104042021040113011213031212100312101622000000口服液体药用高密度聚

19、乙烯瓶( medicinal high density polyethylene bottles for oral liquid)22114130122123200370035000300000口服液体药用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottles for oral liquid)2021052001320000药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2021，34( 6) 1104 口服液体药用塑料瓶微生物限度检查结果( 美国药典 36 版薄膜过滤法)表 4Tab 4 esults ofmicrobial limit

20、test of medicinal plastic bottles for oral liquid( filtration method in USP 36)需氧菌总数( TAMC) / cfu per bottle样品( sample)批号( batch No )1#2#3#4#5#6#7#8#口服液体药用聚酯瓶( medicinalpolyester bottles for oral liquid)1304031305011302201111211220400000000000001304010221100013020112122213030461301131304111011511123

21、221660004700066000270000500000202104011212030020210204130402202103012021040843130111022002300200040004000500202103096111000020210317001210002021040414444000口服液体药用聚丙烯瓶( medicinal polypropylene bottles for oral liquid) 口服液体药用高密度聚乙烯瓶( medicinal high density polyethylenebottles for oral liquid)202104012

22、200000013011213031212100312101622114130122123200370035000300000口服液体药用聚丙烯易折瓶( medicinal polypropylene easily broken bottles for oral liquid)20210520013200003. 3污染菌株的分析结果采用全自动细菌鉴定试验系统对从口服液体药3. 4. 1提取液制备方法对实验结果的影响由于塑料瓶具有透气、透湿和吸附作用，经过高温注吹的塑料瓶，在包装、运输、存放过程中容易受到微生物 污染12，因 此，本实验采用参加 含 验 证 菌 的 0. 9%无菌氯化钠 溶 液

23、 至 塑 料 瓶 中，充 分 振 摇，薄 膜 过 滤后，将滤膜贴至胰酪大豆胨琼脂培养基平板上培养， 观察结果，计算回收率，回收良好。结果证明，使吸 附在瓶壁的污染微生物能被更彻底地洗脱下来，从而提高检出率。用塑料瓶中检出的污染菌进行菌株鉴定。检出里拉微球菌、变异微球菌( 易变微球菌) 、放射形根瘤菌、缓慢葡萄球菌、表皮葡萄球菌、玫瑰微球菌、粪产碱 杆菌、枯草芽孢杆菌、阴道加德纳氏菌、溶血葡萄球菌、猪葡萄球菌、头状葡萄球菌头状亚种、多杀巴斯 德氏菌、西地细菌 EO 2 群、施氏葡萄球菌施氏亚 种、环状芽孢杆菌、短芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨大 芽孢杆菌、人 葡 萄 球 菌、浅 绿 气 球 菌 (

24、绿 色 气 球 菌 /龙虾加夫基 氏 菌) 、马 红 球 菌、浸 麻 类 芽 孢 杆 菌、水生棒状杆菌、地衣芽孢杆菌、共计 25 株污染菌。不 同样品中的污染菌没有规律性，提示其为随机污染。 上述污染菌株多为环境常见菌，没有危害性较大的致病菌8。3. 4实验操作对结果的影响3. 4. 2冲洗方法对实验结果的影响 由于直接采用薄膜过滤器的针头很难将塑料瓶中的提取液全部取出，且在操作时容易造成污染。所以，应将塑料瓶 内的提取液全部移至适宜的无菌容器中( 输液瓶) ，再进行薄膜过滤，从而提高实验结果的准确性。对口服液体药用塑料瓶微生物限度检查方法3. 5的探讨药物分析杂志 Chin J Pharm

25、Anal 2021，34( 6) 1105 微生物限度检 测) J Tianjin Pharm ( 天 津 药 学 ) ，2003，15( 4) : 21KUANG Pei lin ( 匡 佩 琳) Discussion about membrane filtra- tion method in microbial limit test for packaging materials of drug( 关于药品 包装材 料微生物限度检查的商 榷) J DrugStand China( 中国药品标准) ，2006，7( 1) : 70National Drug Packaging Contain

26、ers( Material) Standard ( Trial)国家药品 包 装 容 器 ( 材 料) 方 法 标 准 ( 试 行) S 2004:Vol 1 6( 第 1 6 辑)LIU Qian ( 刘 倩 ) ，ZHANG Yuan ( 张 媛 ) ，GAO Hua ( 高 华 ) Biosafety suggetions in current National Drug Pakaging Contain-ers ( Material) standard( 对现行?国家药 品 包 装 容 器 ( 材 料) 方法标准?中生物平安相关标准的几点修改建议) J Chin J Pharm Ana

27、l( 药物分析杂志) ，2021，32( 10) : 1889ChP 2021 Vol ( 中国药典 2021 年版 二部) S 2021: Ap- pendix( 附录) 107USP 36 NF 31S 2021: 61FANG Hai( 房海) ，CHEN Cui zhen( 陈翠珍) ，ZHANG Xiao jun( 张晓 君) Pathogenic Bacteria of Enterobacteriaceae ( 肠 杆 菌科病原细菌) M Beijing ( 北 京 ) : China Agricultural Sci- ence Press( 中国农业科技出版社) ，2021:

28、89ChP 2021 The Second Supplement ( 2021 年 版 中 国 药 典 第 二 增补本) Appendix ( 附 录) H 非无菌产品微 生 物 限 度 检 查: 微 生 物 计 数 法 ( Microbial Limit Test of Non sterileProducts: Counting of Microorganisms) EB / OL 2021 2 26 : / / www chp org cn / cms / newscenter / subjects /2021 ydzbzqyj /000029 htmlEP 6. 0S 2007: 166

29、BP 2002S 2002: 315JP 14S 2000: 60YOU Ya ning ( 由 亚 宁 ) ，CHEN Xue qin ( 陈 雪 芹 ) ，ZHOU Zhi yun( 周志云) ，et al Compare the colony counting method between the 2005 version Chinese Pharmacopeia and the mainly overseas pharmacopeia ( 2005 年 版?中 国 药 典 ?和?欧 洲 药 典?菌落计数培养基比拟) J Chin Pharm Aff( 中国药事) ，2021，24( 6) : 587LU Jun( 鲁军) ，OUYANG Su ying( 欧阳素英) Study for mi- crobial limit inspection method of eye drug plastic tube( 塑 料 滴 眼瓶微生物限度检查方法探讨) J Huaihua Univ J( 怀化学 院学报) ，2007，26( 2) : 11( 本文于 2021 年 9 月 4 日收到)按照 目 前 国 内规定的药包材微生物计数方 法4，要求对口 服 液 体药用塑料