碱水解法提高黄芪药材中黄芪甲苷的工艺研究

1、碱水解法提高黄芪药材中黄芪甲苷的工艺研究张金红，周晶，宋慧琴，吴志丽【摘要】目的成立碱水解法提高黄芪药材中黄芪甲苷收率的最正确工艺。方式以黄芪甲苷的收率为考察指标，采纳正交实验对黄芪甲苷的提取工艺进行优选。考察NaOH度、水解时刻及料液比对黄苣甲甘收率的阻碍，采纳高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD测定其含量。结果NaOH§液的浓度对黄苣甲甘的收率起要紧作用，最正确工艺条件为：NaOHS液的浓度为molL-1,室温静置水解2h,黄苣药材与碱溶液的料液配比为1：12,黄苣甲甘的含量约是未经碱水解组的倍。结论碱水解法可显著提高黄芪药材中黄芪甲苷的含量。方式简便易行，有效价值高，

2、为工业化生产提供了依据。【关键词】碱水解法;黄芪;黄芪甲苷;正交实验黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge的干燥根。黄芪皂苷是黄芪的要紧药效物质之一，黄芪皂苷大部份是以环黄芪皂醇为苷元的皂苷，黄芪甲苷(astragalosideIV)为其要紧成份1，常作为黄苣药材及其制剂的质量操纵定量的指标。药理研究说明，黄芪甲苷具有强心护心、爱惜神经系统及内皮屏障功能、改善血液流变学、调剂机体免疫功能、抗衰老、抗胃溃疡等功能，另外

3、，还具有降血压、镇痛镇定、增进胰岛素分泌等作用2。黄芪甲苷尽管药理作用显著，但其在黄芪药材中的含量很低，提取分离较困难，使其应用受到极大的限制。本研究利用皂化反映原理，在NaO昨用下将环黄苣醇皂甘转化为黄苣甲甘，通过正交实验优选黄芪甲苷转化的最正确条件，提高黄芪甲苷的收率，为黄芪甲苷单体制剂的研制开发奠定研究基础。1仪器与试药仪器Agilent1100高效液相色谱仪，Alltech2000ES型蒸发光散射检测器，AT-330柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器），XWK-3Ag气泵（天津市华生分析仪器厂）;SZ-93自动双重纯水蒸馏水器（上海强运科技）;BP-211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）;K

4、S-600D超声清洗机（宁波科生仪器厂）;W2-100旋转蒸发仪（上海申生科技）;PHS-25型酸度计（杭州亚美电子仪器厂）。试药黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号为）;黄芪药材（购自天津市药材公司，批号为Y0805267,由天津医科大学生药学教研室周晔教授鉴定，符合中国药典2005年版I部要求）;AB-8型大孔吸附树脂（南开大学树脂厂）;乙腈（天津康科德科技，批号：080426）色谱纯，氢氧化钠为分析纯;流动相用水为重蒸水。2方式与结果色谱条件及系统适用性实验色谱柱：DiamonsilC18mrt250mm5m)；流动相：乙睛-水(34:66);体积流量：mlmin-1;柱温：35

5、C;漂移管温度：105C;载气流量：Lmin-1;压力：MPa;进样量：10l。此色谱条件下，黄芪甲苷色谱峰与样品中其他组分色谱峰可达基线分离，分离度大于，理论塔板数以黄芪甲苷峰计不低于4000。黄芪药材提取液的制备称取黄芪药材200g，置于圆底烧瓶中，各次加乙醇量别离为药材干重的10，8，8倍，90水浴回流提取3次，各次回流时刻别离为2，1h。每次回流后趁热过滤，滤液归并浓缩后定容至500ml,备用。精准吸取上述提取液5ml,按设定的实验条件进行水解后，调剂pH至中性，上AB-8型大孔吸附树脂，流出液重复上样一次，用3BV蒸储水洗脱树脂，再用4BV70%乙醇洗脱树脂，搜集70%乙醇洗脱液，于

6、旋转蒸发仪减压浓缩近干，用70%乙醇溶解并定容于10ml量瓶中，过wm微孔滤膜，取续滤液，即得黄芪药材样品液。a.黄芪甲苷对照品;b.碱水解前样品;c.碱水解后样品;1.黄芪甲苷图1黄芪甲苷标准品及黄芪药材提取液碱水解前后的HPLC®方式学考察线性关系的考察准确称取经减压真空干燥至恒重的黄芪甲苷对照品mg,置于50ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储蓄液。别离周密吸取黄芪甲苷对照品储蓄液，1，2，4，6，8ml，置于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，别离周密吸取上述溶液各20”,注入高效液相色谱仪，依照""项下色谱条件测定黄苣甲昔的峰面积，以黄苣甲

7、昔进样量(wg)的自然对数值为横坐标(X),以峰面积的自然对数值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并计算回归方程，Y=8X+，r=8。黄苣甲昔在wg范围内具有良好的线性关系。周密度实验周密吸取黄苣甲甘对照品溶液10屋，注入液相色谱仪，持续进样6次，测定黄苣甲昔峰面积值RS防(n=6),说明仪器的周密度良好。稳固性实验取同一份碱水解工艺制备的黄芪药材供试液，于0，2,4,8,12,24h别离进样，测定黄苣甲昔峰面积值RSM%(n=6),说明黄芪药材供试液在24h内稳固。重复性实验周密吸取6份黄芪药材提取液各5ml至50ml圆底烧瓶中，依照相同的碱水解工艺条件制备黄芪药材供试液，测定并计算黄苣甲甘的含

8、量，RSM%(n=6),说明本处置方式制备黄苣甲甘的重复性良好。加样回收率实验取经碱水解工艺制备的已知黄芪甲苷含量的供试液ml至10ml量瓶中，共9份，每份别离按相当于碱水解后黄芪供试液中黄苣甲甘含量的80%,100%,120%加入黄苣甲昔对照品溶液，加70%乙醇定容至刻度，过m微孔滤膜，取续滤液，测定并计算黄苣甲昔的回收率。结果说明，黄苣甲甘的平均回收率别离为,%和,RSDgU离为,%和。正交实验法优化黄苣药材的碱水解工艺在考察了NaO嵌度，碱水解时刻和料液比等单因素对黄芪甲苷转化率阻碍的基础上，对上述因素水平设计L9（34）正交实验，以每克黄芪生药中含有黄芪甲苷的量（mg）作为评判指标，挑

9、选最正确工艺。各因素水平见表1。表1正交实验因素水平表L9正交实验样品的制备及测定精准吸取“”中未经碱水解的黄芪提取液5ml，按表2正交实验条件进行水解后，继续按“”项下操作，每次实验平行2份。照“”项下色谱条件之外标两点法对数方程计算黄芪甲苷的含量。结果见表2。表2正交实验结果由表3可知，因素A（NaOH浓度）对黄苣中黄苣甲甘的收率具有显著性阻碍（P<因素B（水解时刻）和因素C（料液比）对黄苣甲甘的收率无显著阻碍。因此，因素A为要紧因素，因素B和C为次要因素，该结论与直观分析法是一致的。因此，结合实际生产，本实验的最正确搭配为A3B2C3即浓度molL-1的NaOHg温静置水解

10、2h,料液比为1：12。表3方差分析表碱水解工艺的验证明验为进一步考察上述最正确工艺的稳固性及合理性，将药材量放大10倍，即取相当于20g黄芪药材的提取液进行实验，依照该工艺进行重复性实验3次，随行进行非水解空白组。结果见表4。表4最正确工艺验证明验结果由表4能够看出，验证明验中黄芪甲苷的含量均高于正交实验各组的含量，通过最正确碱水解工艺水解后的黄芪甲苷含量比未经碱水解组明显增高，约是未经碱水解的黄芪皂苷样品中黄芪甲苷含量的倍，说明本实验确信的黄芪皂苷的最正确碱水解工艺稳固可行，关于黄芪甲苷的生产具有专门大的有效价值。碱水解前后黄芪总皂苷的含量3周密称取未经碱水解和碱水解后提取所得黄苣皂昔粗品

11、各约mg,用无水乙醇超声溶解并定容于25ml量瓶中，过滤，取滤液作为样品液。周密吸取ml样品液，各加无水乙醇至ml，再别离加入ml8%香草醛无水乙醇试剂，置于冰浴中缓缓加入ml72%(V/V)的硫酸，旋涡混匀2min，放入62水浴中，保温30min,掏出，置冰浴冷却10min,摇匀，当即于波长540nm处测定吸光度，随行试剂空白，测定3次，每一个样品平行做3份。表5碱水解前后黄芪总皂苷的含量由表5能够看出，黄芪皂苷碱水解前后黄芪总皂苷的含量转变不大，采纳配对t查验，二者的不同无统计学意义，尚不能以为黄芪总皂苷碱水解前后的含量有转变。说明该方式不阻碍黄芪总皂苷的含量，而是提高了活性较强的黄芪甲苷

12、的含量。3讨论国内外学者1对黄芪中黄芪皂苷作了深切的研究，已分离鉴定了数十种黄芪皂苷，其中大多数皂苷以环黄芪皂醇为苷元，以配糖体部份不同而分类，黄芪甲苷糖体3个位置均连着-OH，其它环黄芪醇皂苷的配糖体上连接-OH或-OAc,本研究的皂化反映原理确实是将黄苣中的环黄芪醇皂苷转化为黄芪甲苷，从而提高黄芪中黄芪甲苷的收率及药用价值。在设计正交实验之前，本文对黄芪皂苷的水解方式进行了挑选，别离采纳了加热回流法和室温静置法进行黄芪提取液的碱水解，通过t查验，结果说明，加热回流法与室温静置水解法对黄芪提取液中黄芪甲苷的收率的不同无统计学意义，为节约本钱消耗，更适用于工业生产的需要，本研究选用了室温静置水解法对黄芪提取液进行黄芪皂苷的水解。中国药典（2005年版）4中对黄芪甲苷含量测定的前处置中，采纳了氨试液洗涤正丁醇萃取液，以使黄芪中黄芪甲苷的含量达到测定的要求，但通过反复洗涤，黄芪甲苷的损失率会大大增加，且氨试液刺激性大。有研究5采纳2%ft90C水浴回流2h,用于提高黄芪中黄芪甲苷的收率，但该法中氨试液浓度较大，且加热回流消耗本钱高，污染环境。因此，本研究采纳了浓度为molL-1氢氧化钠在室温静置碱水解，减少了氨试液对环境的污染，降低本钱消耗，该操作方式易于在工业生产中实施。【参考文献】1 余灏，杨胜华.黄芪皂甙分析方式研究现状J.华西药学杂志，1993，8(3