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文档简介
1、RNA提取标准流程原理:TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中,取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。预防RNase污染注意事项:1 经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。2 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3 RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌,然后烘干即可。4 配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度
2、0.05% v/v,充分混匀后37ºC放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作。)RNA的提取准备试剂:氯仿,异丙醇(可保存在-20ºC,用时取出置于冰上),75%乙醇,无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer(宝生物工程(大连)有限公司,货号:D603,35元,1mL×5支)准备器材:1 mL、200 L枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppendorf管若干、报纸、卷纸、研钵,以上物品全部需要高压。操作步骤:1. 研磨+匀浆:将组织在液氮中磨
3、碎(大体积不均一的样品,如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体,必须对整个组织研磨),取50100 mg1 / 10组织样品(肝脏可减少样品量到30 mg)放入2 mL离心管中,称重记录;均一组织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50100 mg组织加入1 mL TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。2将匀浆样品在室温(1530ºC)放置5 min(可延长到15 min),使核酸蛋白复合物完全分离。 可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖(如肝脏和肌肉中的糖原)或胞外物质(肌肉)可于28 10000 × g离心10
4、 min,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量基因组DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿,剧烈振荡60 s(可使用混匀器,也可手动剧烈颠倒混匀),室温放置3 min。(可延长震荡时间和放置时间到15 min,同GTC法)4. 4ºC 10000 × g离心15 min。样品分为三层:底层为红色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。(即1mL最多600µl,为保证RNA
5、质量,可适量减少抽取量,防止抽到下层)5. 记录抽取水相的量,把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中,用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。 a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇,室温放置10 min。 b. 可选:应对糖原含量较高的组织(如肌肉和肝脏):每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl)混合离心,这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,沉淀出RNA。6. 4ºC 10000 × g离心10 min,离心前看不出RNA沉淀(肌肉和肝脏等富含糖原的组
6、织可能出现大量糖原沉淀),离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。4不超过7500×g离心5 min,弃上清。9. 室温放置于超净台通风口(垫上已灭菌的吸水纸)干燥RNA沉淀,大约晾510 min即可,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水,记录使用的DEPC水体积(适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少 0.5 g/L,但不影响溶解,浓度在4 g/L以上的RNA较容易出现溶解不完全的情况),使之充分溶解(可选择4放置1 h以上或
7、5565ºC水浴10 min),之后才可以进行测浓度、DNA污染的PCR验证、RNA变性电泳等后续操作。RNA应尽快转移至-70ºC保存。 也可用100%的去离子甲酰胺溶解(用于northern的RNA可这样保存于-20ºC)。补充说明:1. 从少量样品(110 mg组织或102104细胞)中提取RNA时可加入少许线性丙烯酰胺等助沉剂以促进RNA沉淀。操作示例:加800 µL TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加浓度为5 mg/mL的线性丙烯酰胺23L RNase-free线性丙烯酰胺溶液。它在使用时最终工作浓度应该为1020 g/mL。线性丙烯酰胺会与
8、RNA一同沉淀出来,线性丙烯酰胺浓度不高于5 µg/µL不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。线性丙烯酰胺制备方法见附录1。2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70ºC保存至少一个月。3. 若提取的组织内源性RNAase含量较高(如胰腺),可将全部过程置于冰上操作,同时适当延长放置时间。预期产量:1 mg组织或1×106细胞提取RNA分别为:肝和脾610 g,肾34 g,骨骼肌和脑组织11.5 g,胎盘14 g,上皮细胞 815 g,成纤维细胞 57 g。RNA的质量控制:1. RNA的吸收峰应在260nm,左偏峰少见,右偏峰提示可能有酚污染。2
9、. 对于RNA纯品:A260/A280=1.81 (溶于水);A260/A280=2.04 (溶于TE:10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH=8.0);A260/A230>2。3. nanodrop使用0.2mm光径,但默认显示的是换算后的1cm光径吸光值,并非其精度能够检测3以上的吸光值(2%以下的透光率)。4. 对于ND-1000(本实验室机器型号),其RNA检出限为2-3000ng/L,大于3000ng/L需要稀释后再测。 1. 使用nanodrop测量RNA吸光值时的几点说明:图一、RNA紫外吸收光谱图三、A260/A280<1.8,提示可能存在蛋白、酚污染图
10、二、A230过高图像,提示可能存在多糖、异丙醇、高浓度无机盐残余2. PCR验证基因组DNA污染:使用RNA作为模板,使用不跨内含子的引物采用进行普通PCR反应,若可以扩增出条带,则说明存在DNA污染。 注:验证时,必须有阴性和阳性对照,阴性对照的模板为DEPC水,阳性对照的模板为cDNA。3. RNA甲醛变性胶验证质量:变性胶做法(每100 mL):72 mL水,1.4 g Agarose (1.4%,胶浓度可调),加热煮沸,待冷却到约60ºC时, 加入 10 mL 10×MOPS (配制方法见附录1),18 mL 甲醛溶液(37%, pH > 4.0),混匀(避免
11、产生气泡)倒入胶槽内,冷却2 h后使用。(放置过长时间会导致甲醛挥发,影响电泳结果)样品处理方法:将RNA稀释到1 g/L,取4.4 L(可减少点样RNA量,但需要保证体积),加2 L的10×MOPS,3.6 L的甲醛,10 L的去离子甲酰胺,共20 L,混匀之后将样品置于65ºC水浴变性15 min,迅速置于冰上冷却。之后加入2 L 10×loading buffer,0.1 L EB(10 mg/mL),混匀后即可点样。电泳:5 V/cm电压,电泳约40 min后(或指示剂到胶的2/3处)照相。注: 若成像结果不佳,可选择EB后染,即不将EB混入样品中,在电泳
12、完成后,使用1 g/mL(储存液稀释10000倍即可)的EB染胶15 min,清水脱色15 min或更长时间,图像对比度会更高,且不会出现反向的EB亮斑。电泳结果分析:好的RNA电泳图可见28S和18S的清晰图像,且亮度呈2倍的关系。图四、RNA电泳示例图,2%的变性胶,对比度经过调整美化常见问题分析:得率低:A样品裂解或匀浆处理不彻底BRNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65 :A检测吸光度时,RNA样品没有溶于TE,而溶于了水中,低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高,水中1.51.8的比值都可能是质量较好的RNAB样品匀浆时加的试剂量太少(造成蛋白未分离完全)C匀浆样品时
13、未在室温放置5 minD吸取水相时混入了有机相ERNA沉淀未完全溶解RNA降解:A组织取出后没有马上处理或冷冻B待提取RNA的样品没有保存于-60至-70ºC,而保存在了-5至-20C细胞在用胰酶处理时过度D溶液或离心管未经RNase去除处理E电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染: A 样品匀浆时加的试剂量太少B 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲体系或碱性溶液附录一、线性丙烯酰胺制备方法1. 配5%的丙烯酰胺(acrylamide)溶液:A配制buffer 100 mL(40 mM Tris-HCl (pH= 8),20 mM 醋酸钠, 1 mM EDTA):
14、称取2.72 g无水醋酸钠,溶于50 mL DEPC水中,向其中加入1 M Tris-Cl (pH=8.0)4 mL,0.5 M EDTA (pH=8.0)0.2 mL,加入盐酸调节pH至8.0,再加DEPC水至100 mL。B称取5 g 丙烯酰胺,加入 100 mL buffer中,高压灭菌后分装至高压过的1.5 mL管中,每管0.2 mL。2. 加过硫酸铵(AP)到终浓度为0.1 %(w/v):A配制10 % AP储存液(w/v):称取0.1 g AP,溶解于1 mL DEPC水中。B向每管5%的丙烯酰胺溶液中加入2 L 10 % AP。3. 加TEMED到终浓度为1/1000(v/v),
15、即向每管中加入0.2 µL TEMED,室温聚合30min。4. 待溶液变粘稠,向管中加入2.5倍体积(500 µL)的乙醇沉淀聚合物,-20 沉淀30 min以上。5. 12000×g离心5 min,沉淀即为线性的丙烯酰胺,每管加入1mL 1×TE buffer 溶解(溶解时间较长,可4 过夜), 即得到终浓度为10 mg/mL的线性的丙烯酰胺1 mL。封口膜密封保存于-20 ,可保存2年。 1×TE buffer( 10 mM Tris-Cl,pH=8.0;1 mM EDTA)配制方法:加入1 M Tris-Cl (pH=8.0)1 mL,0.5 M EDTA (pH=8.0)0.2 mL ,加入DEPC水至100 mL,高压灭菌备用。6. 使用时先加1020 µg(就是12 µL)到核酸(RNA、DNA均可)溶液中,之后再加相应的盐溶液和异丙醇进行沉淀。对于20 nt以上的片段,号称可以无损回收pg级的核酸。二、10×MOPS (0.2 M
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