食品中组胺的测定.总结

1、组胺的检测组胺是自体活性物质之一，在体内由组氨酸脱羧基而成，组织中的组胺是以无活性的结合型存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中，以皮肤、支气管粘膜、肠粘膜和神经系统中含量较多。当机体受到理化刺激或发生过敏反应时，可引起这些细胞脱颗粒，导致组胺释放，与组胺受体结合而产生生物效应。抗组胺是拮抗组胺对人体的生物效应，即应用抗组胺药物。抗组胺受体就是拮抗组胺的 H1 和 H2 受体。由于此两种受体在人体内分布不同而产生不同的效应，它是抗组胺药应用治疗疾病的生理药理基础。毒理药物中毒 组胺主要用于胃分泌功能检查，作最大酸分泌 (MAO)测定。但目前已被五肽胃泌素 取代。组胺通过激活体内组胺 H1受体和

2、H2受体，收缩多种平滑肌如气管、支气管和胃肠道平滑肌；但同时松弛小血管平滑肌，增加毛细血管通透性；还能强烈刺激胃酸分泌，减慢房室传导，增加心肌收缩力等。误用大剂量或静脉给药可引起中毒。食物中毒大量检测表明，海产鱼中的青皮红肉鱼类含组胺较高，当鱼不新鲜或腐败时，鱼体中游离的组胺酸经脱羧酶 作用产生组胺 .组胺中毒 潜伏期一般为 0.51 小时，最短可为5min, 最长达 4h.检测方法1分光光度法1 主要仪器和试剂721型分光光度计组胺标准溶液：取经 95干燥 25小时的磷酸组织胺分析纯试剂配制成含 20ug·ml 的组胺标准溶液。 0 2 对氨基苯磺酸溶液 ( 简称甲液 )1oNNa

3、NO溶液( 简祢乙液 ) ，现配现用。所用水均为二次蒸馏水。2 组胺测定方法及条件试验21 测定方法：在 25ml容量瓶中，移入一定量的组胺标准溶液，依次加入0-2甲液、 04%HCI、10%乙液和 2 0%NaCO溶液，用水稀释至刻度，摇匀。于25室温下放置 20分钟，用试剂空白为参比，测其吸光度值。22 吸收光谱：取 20ml组胺标准溶液，按上述方法显色，以水为参比，分别测定显色化合物和试剂空白的吸收光谱。图 1表明显色化合物在 506nm 处有一最大吸收，本实验取 506nm 作为吸收波长。23 显色条件试验231 Na CO 用量对显色反应的影响：试验结果如图2(a) 所示：该显色反应

4、必须在碱性溶液中才能进行，此时在碱性介质中组胺与重氮酸盐起偶联反应。232 HC1用量对显色反应的影响：图2(b) 表明随着 HCI用量增加，进行重氯化反应的程度也随之加快当 HC1加入量在 0510ml之间，吸收达最大值。2高效液相色谱法1 材料与方法1 1 仪器与试剂美国 Biorad 700高效液相色谱仪， 1706 UV 紫外检测器，分析天平，恒温水浴箱，均质机，离心机， 0 45m 针头微孔滤膜过滤器等。组胺标准品由广东省疾病预防控制中心提供，纯度99%。氨水 ( 25%) 、碳酸氢钠、高氯酸、氢氧化钠、丹酰氯均为分析纯，甲醇、丙酮和乙腈均为色谱纯，实验用水均为双蒸水，并经 Mill

5、i Q 超纯处理。溶液配制 :称取一定量的组胺标准品，用0 4mol / L 高氯酸配制成浓度为1 mg / mL的组胺标准溶液，放于冰箱中 4 保存，一周一配。精确称取适量丹磺酰氯，用丙酮溶解并配制成浓度为10 mg/mL 的溶液，经过 0 45 m 针头微孔滤膜过滤器过滤后，4 冰箱中保存，备用。1 2样品采集与处理于广州市某大型超市购买具有相近生产日期、不同品牌的大豆发酵酱油、豆酱各三种，盒装及散装豆豉各一种，酸奶六种，啤酒( 易拉罐装 ) 五种。豆豉和豆酱分别取出适量，于研钵中捣碎、混匀，酸奶和酱油摇匀。准确称取2 0g 豆豉或豆酱样品 ( 酸奶 5 0 g ，酱油 2 0 mL)，置

6、于 15 mL 离心管中，加入 10 mL 0 4 mol / L高氯酸，用均质机捣碎、混匀，在3000 r / min的条件下离心 10 min; 取出上层清液，再次加入 10 mL 0 4 mol/L 高氯酸，充分混匀，在 3000 r / min 的条件下离心 10 min; 取出上层清液，合并两次清液并过滤，用 0 4 mol/L 的高氯酸定容到 25 mL。取啤酒样品 20 mL 于小烧杯，室温超声脱气 20 min 。准确量取 5 mL 于 15 mL 离心管中，加入 2 5 g 氯化钠，振荡使之溶解并达到饱和，再加入 3 mL 正丁醇 氯仿 ( 体积比 50 50) 溶液，加盖旋

7、紧，充分振荡 10 min ，于 3000 r/min 条件下离心 10 min ，取上层清液 2 mL 于离心管中，于 40 水浴条件下氮气吹干后，再加入0 1 mol/L盐酸 0 5 mL 。1 3柱前衍生取样品提取液 0 25 mL ，加入 25 L 2 mol/L的氢氧化钠调节pH 值，加入 75L 饱和碳酸氢钠溶液和 0 5 mL 10 mg/mL 丹酰氯 丙酮溶液，摇匀，于40 水浴下避光反应 45 min;反应毕，取出加入 25 L 25% 的浓氨水，静置 30 min ，用乙腈定容至 1 25 mL ，振荡混匀。将衍生后溶液用0 45m 针头微孔滤膜过滤器过滤，用高效液相色谱测

8、定。1 4色谱条件 Biorad 700 高效液相色谱系统，配 1706 UV 紫外检测器。检测条件 : Hypersil C18色谱柱 ( 250 ×4 6 mm I D ，粒径 5 m) ，柱温为室温 ;流动相 V( 乙腈 ) V(水) = 60 40; 流速 1 0 mL/min; 紫外检测波长254 nm; 进样量 20L;采样时间 30 min; 以峰面积为定量指标。3酶联免疫吸附试验法1仪器设备、试剂和方法11 仪器设备450nm 波长微量酶标仪 , 均质器 ,离心机 , 微量加样器 , 微量多通道加样器 , 紫外分光光度计。12 试剂正戊醇 ,三氯乙酸溶液 ( 100g

9、 /L ),碳酸钠溶液 ( 50g /L),氢氧化钠溶液( 250g /L ), 盐酸 ( 1+ 11) 。试剂均为优级纯 , 所用水为蒸馏水。酶联免疫吸附分析定量检测组胺残留试剂盒为德国 R-B iopharm 公司制造。13 检测方法131 紫外分光光度法 (GB /T 5009145-2003) 4 鱼体中组胺用正戊醇提取遇偶氮试剂显橙色 , 与标准系列比较定量 , 检测限为 50mg /kg 。,132 EL ISA法样品处理 :取3g均质物于 27mL 蒸馏水混合后 ,取 1mL悬浮液放入离心管中 ,在室温 ( 20e 25e )离心 5m in( 2500g) ,吸除脂肪层 ,10

10、mL 蒸馏水稀释。酰化 :所有标准 ( 0Lg /L、015Lg /L取20LL的上清液用、 115Lg /L 、5Lg /L、15Lg /L和50Lg /L) 溶液、质控及样品都做平行样,记录好标准、质控和样品的位置 ,分别向酰化板孔中加入 100LL的标准溶液、质控及样品,加入 25LL的酰化试剂到各微孔中 , 加入 200LL的酰化缓冲液到各微孔中,轻轻摇动并混合均匀 ,室温 ( 20e 25e )孵育 15m in 。EL ISA 测定 : 将足够标准溶液、质控和样品所用数量的微孔板插入微孔架, 标准溶液、质控和样品做 2个平行实验 ,标记各自位置 , 加入 25LL 酰化的标准溶液、

11、质控和样品液到各自的微孔中 ,加入 100LL组胺抗体到每一个微孔底中充分混合 , 在室温 ( 20e 25e )孵育 40m in, 倒出孔中的液体 ,将微孔板架倒置在吸水纸上拍打 ( 每轮拍打 3次) 以确保完全除去孔中的液体, 将 250LL洗涤缓冲液加入孔中 , 再次倒掉微孔中的液体 , 重复 2次上述的操作 ,加入 100LL 酶标记物到每一微孔中 , 充分混合并在室温孵育 20m in, 洗板 , 重复上述的洗板操作步骤 , 加入 100LL 底物 / 发色剂到每 - 微孔中 , 充分混合后在室温暗处孵育 15m in, 加入 100LL 反应终止液到每一微孔中 , 充分混合后在波

12、长 450nm 处测定吸光度值 , 以空气为空白 , 必须在加入反应终止液后 10m in 内读取吸光度值。结果计算 :所获得的标准、质控和样品吸光度值的平均值除以第一个标准溶液( 零标准 ) 的吸光度值再乘以 100%, 因此零标准溶液的吸光度值等于100%, 吸光度值以百分比表示。吸光度值=标准溶液的吸光度值 ( 质控或样品溶液的吸光度值 ) 零标准溶液的吸光度值 *100% 4电化学检测组胺实验方法衍生化反应在室温下进行。取待测溶液 50 LL 加入 10 LL 衍生化试剂 ,超声反应 1 min 后置于冰水中终止反应。碳圆盘电极的制备 : 取干净滴管 ,以300 Lm石墨做电极芯 ,

13、铜丝铜棒做引线。电极芯用胶水固定在滴管细端中心,约0. 5cm 伸出玻璃管外 ,悬挂固化 24 h 。电极芯的另一端用铜丝引出,并用铜棒固定在滴管的另一端。毛细管使用前用 0. 1 mo l/ L NaOH 、二次水、缓冲液分别冲洗 5、 2、 10 min 。电极使用前用细砂纸打磨 , 并超声波清洗 , 以三维定位调节器使工作电极与毛细管出口在同一直线上 , 在毛细管末端 , 以 50 mmol/ L 硼砂- 硼酸缓冲液为运行液 , 采用电动进样。溶液使用前均用 0. 22 Lm 滤膜过滤。毛细管电泳 - 电化学发光法实验方法实验前将毛细管依次用 1 mol/L HCl ， 超纯水， 0.1

14、 mol/L NaOH冲洗 20 min ，然后用运行磷酸盐缓冲溶液平衡812 h 。检测池中采用三电极体系，工作电极为 Pt 盘电极， 参比电极为 Ag/AgCl 电极，对电极为 Pt 丝电极，在显微镜下将毛细管出口与工作电极对齐， 调节两者距离约 100 m。检测池中添加 250 L Ru（bpy）32+和 50 mmol/L 磷酸盐混合液。为了获得良好的重现性，减小由于溶剂蒸发等因素的影响，每2 h更换 1 Ru（bpy）32+。光电倍增管高压设为 800 V ，将毛细管进样管端插入缓冲液中，待发光信号基线稳定后进样检测。样品前处理：称取 5 g已均质样品于50 mL离心管中，加入 10 mL 6% HClO41518 均质 1 min ， 4 000 r/min下离心10 min ， 取上清液于 50 mL 容量瓶中，残渣中加入 10 mL 6% HClO4重复萃取 1次， 合并 2 次上清液，用6% HClO4定容至 50mL。若有必要，可用 6% HClO4进行稀释，以确保所得浓度在线性范围内。使用前再用0.22m 的醋酸纤维滤膜过滤。书是我们时代的生命 别林斯基书籍是巨大的力量 列宁书是人类进步的阶梯 高尔基书籍是人类知识的总统 莎士比亚书籍是人类思想