静脉血栓栓塞症患者活化蛋白C抗性及凝血因子Ⅴ活性和基因多态性研究

1、            作者：韩轩茂，任景芳，郝斌，曹文东，刘秀娥， 侯丽虹，                     郭志萍，于斌，王学峰，丁秋兰，杨林花【摘要】  本研究旨在观察静脉血栓栓塞患者凝血因子（Factor, F）活性改变，检测活化蛋白C抗性（activated p

2、rotein C resistance, APCR）和凝血因子基因FLeiden、 FCambridge、FHong Kong、 FAsp79His和FI359T多态性。对95例静脉血栓栓塞患者（其中下肢深静脉血栓79例，肺栓塞4例，下肢深静脉血栓合并肺栓塞12例）和95例正常对照者。应用限制性内切酶片段长度多态性测定FV Leiden、FCambridge和FHong Kong多态性， 用MassARRAYTM技术检测FAsp79His、FI359T多态性。以一期法和校正的APTT试验分别对其中的65例静脉血栓栓塞患者和60例正常对照者行凝血因子活性水平和活化蛋白C抵抗检测。结果表明：静脉血

3、栓栓塞患者血浆凝血因子活性水平（108.03%±28.29%）高于对照组（95.17%±29.75%），差异有显著性统计学意义（P=0.008)；静脉血栓栓塞组活化蛋白C抵抗阳性13例（20.0%），对照组3例（5.0%），二组比较，有统计学意义（P=0.012）。二组均未发现FV Leiden、FCambridge、FHong Kong、 FVAsp79His和FV I359T多态性。结论：凝血因子活性升高和活化蛋白C抵抗是静脉血栓栓塞的危险因素，但APCR与FLeiden、FCambridge、FHong Kong、 FAsp79His和FI359T多态性无关。 【关键

4、词】  静脉血栓栓塞 活化蛋白C抵抗 凝血因子 基因多态性 Analysis of Activated Protein C Resistance, Factor V Coagulation Activity and Gene Polymorphisms in Patients with Venous Thromboembolism       Abstract    The study was aimed to investigate  the  factor V coagu

5、lation activity (F:C), and to evaluate  Fgene polymorphisms and activated protein C resistance (APCR) in the patients with venous thromboembolism (VTE). 95 patients with VTE and 95 normal controls were investigated for F gene polymorphisms. FV Leiden, FCambridge, and FHong Kong were detected by

6、 PCR, MnlI and BstNI digestion respectively. FAsp79His and FI359T were detected by MassARRAYTM. F:C and APCR in 65 patients with VTE and 60 normal controls  were determined by a onestage clotting method and the APTTbased assays respectively. The results showed that the mean levels of plasma F:C

7、 were significantly higher in VTE group than that in controls  (108.03%±28.29% vs 95.17%±29.75%)  (P=0.008), the incidence of APCR were 20.0% (13 of 65 cases) in patients with VTE and 5.0% (3 of 60 cases) in normal controls (P=0.012）. FV Leiden, FCambridge, FHong Kong, FAsp79His

8、and FI359T mutations were not found in two groups.  It is concluded that  the increased plasma level of F:C is a risk factor for VTE. There is APCR in both groups, APCR is also a risk factor to VTE. APCR may not be associated with  mutations of FV Leiden, FCambridge, FHong Kong, FVAsp

9、79His and FV I359T polymorphisms, other factors need to study further in APCR.    Key words    venous thromboembolism;  activated protein C resistance;   factor V          coagulation activity;   gene

10、  polymorphisms    J Exp Hematol 2007; 15(3):612-616    静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism， VTE）包括深静脉血栓形成 （deep venous thrombosis， DVT）和肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism， PTE），是一组严重危害人类健康和生命的疾病。在西方国家的人群中，VTE是仅次于冠心病和高血压的重要疾病。年发病率约为1-5，且复发率高（2年1，8年30.3）。在美国，每年发生VTE的病例约为20

11、0万，其中1/3为PTE，2/3为单独的DVT 1。在我国尚缺乏大规模流行病学调查资料,但VTE也是一种常见病和多发病，且发病率呈上升趋势。   静脉血栓栓塞症患者活化蛋白C抵抗和凝血因子基因多态性的检测本研究旨在观察静脉血栓栓塞患者凝血因子活性水平，了解活化蛋白C抵抗和凝血因子基因FVLeiden、 FVCambridge、FVHong Kong、 FVAsp79His和FVI359T多态性在静脉血栓栓塞患者中的发生率。    材料和方法    研究对象    VTE组：选自山西医科

12、大学第二临床医学院和上海血液病研究所2004年3月至2005年9月住院及门诊VTE患者，共95例，男56例，女39例，年龄16- 82岁，平均50.8±14.3岁；其中深静脉栓塞（DVT）79例，肺栓塞（PE）4例，DVT合并 PE 12例。诊断标准参照中华医学会呼吸病分会制订的肺血栓栓塞症的诊断与治疗指南(草案)。DVT通过病史、多普勒超声或静脉造影确诊，PE由血管造影或通气灌注肺扫描证实。其中DVT患者均发生于下肢，包括腘静脉、股静脉、或髂股静脉。排除疾病：恶性肿瘤、骨髓增生性疾病、系统性红斑狼疮、全身感染、创伤、长期制动、口服避孕药和肝、肾功能异常。  &#

13、160; 对照组：选自山西医科大学第二临床医学院体检中心健康者共95例，其中男54例，女41例，年龄23-71岁，平均52.0±13.8岁。经常规检查未发现异常者，无VTE史、无动脉疾病（脑卒中、心肌梗死和周围动脉疾病）、无反复妊娠丢失及肿瘤病史。    标本采集    研究组与对照组均采用3.8%枸橼酸钠抗凝管，空腹抽取肘静脉血4 ml，  2000×g离心15分钟，分离血浆和血细胞，-80分别冻存，待测。    FC检测    FC试剂盒购自

14、德国Dade Behring公司，一期法行FC水平测定。    APCR检测    采用BIOCLOT FaaPC Resistance试剂盒，SYSMEX CA7000型血液凝固仪。用校正的APTT法行APCR测定，APC比值2.0提示APCR。    F基因多态性检测    基因组DNA的抽提  按常规酚氯仿异戊醇抽提法抽提基因组DNA。标化DNA浓度为5-15 ng/l。    多聚酶链反应限制性内切酶长度多态性（polymera

15、se chain reaction restriction fragment length polymorphism,  PCRRLFP）分析   PCRRLFP分析FLeiden和R306（FCambridge或FHong Kong） 用以扩增包含1691G/A和R306片段引物序列，详见表1。    PCR条件  1691G/A和R306片段的PCR条件相同，取各样本基因组DNA 0.5 g, PCR反应总体积为25 l, 引物终浓度为1 mol/L，缓冲液及dNTP浓度按照常规。在热循环仪上（PTC200 MJ RES

16、ARCH公司）95预变性5分钟；95变性30秒，60 30秒，72延伸30秒，共30个循环；延伸，10分钟。PCR 产物在2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。    1691G/A片段的酶切  取PCR 产物10 l, Mnl I 酶(Biolabs) 4 U , 于37酶切3小时，溴化乙锭染色, 紫外灯下观察。    R306片段的酶切  取PCR 产物10 l, BstNI 酶(Biolabs) 1 l及酶切缓冲液2 l, 于37酶切16小时。酶切产物于2% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, 在紫外灯下观察，拍照。

17、60;   基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析（matrixassisted laser desertion/ioni timeof flight mass spectrometry, MALDITOF）  MALDITOF检测FVAsp79His、FV I359T多态性引物由上海申兰生物技术有限公司合成。    引物  FV AsP79His   P1:  ACGTTGGATGTTGAGGATGGATGCTCAAGG； P2:  ACGTTGGATGTGGGCCTACTTTATA

18、TGCTG。 FV I359T      P1:  ACGTTGGATGGGACTCATCTTCGTACTGTG；                       P2:  ACGTTGGATGATACAGGTCTCAGCATTTGG。    PCR多重扩增  反应体系：总

19、体积20 l，其中10×Buffer 0.625 l，引物(10PM) 0.05 l×2，dNTPmix (10 mmol/L) 0.254 l, MgCl2(25 mmol/L)0.325 l, Hotstar Taq酶 0.03 l，DNA模板(5-10 ng) 1 l。 反应程序：95 15分钟, 95 20秒, 56 30秒, 72 1分钟, 45个循环，72 3分钟；4 。    PCR产物纯化  反应体系：总体积7 l，其中PCR产物5 l，SAP混合液2 l (SAP 0.3 l, hME buffer 0.17 l)。反应程序