生物技术大实验

1、BIOCHEM AND MICROBIOEGN 生物技术大实验实 验 指 导 书指导教师：王志刚 王昌河 齐齐哈尔大学生命科学与工程学院2序 言随着国家经济社会及教育改革的发展，现有的人才培养模式不能满足当今社会对综合型、应用型及创新型人才培养的需求，教学内容和课程体系改革是人才培养模式改革的主要落脚点，教学方法和教学手段是实现教学目标、落实人才培养模式、提高素质教育的重要因素，而实验教学水平和实验教学层次则直接影响到学生的知识水平、专业技能和综合素质的提升。生物技术大实验打破了传统的单一知识点单一实验的作坊式实验教学模式，综合了微生物学、生物化学及生物工程的基本知识和技能，将相关知识点自然有

2、序地贯穿于整个实验教学环节。为生物科学专业开设生物技术大实验是学院进行大胆的创新性尝试，深化本科实验教学改革，突出学生综合应用能力及创新能力的培养，探索并建立多学科交叉融合，具有连续性、综合性和设计性的大实验教学模式，为国家及地方高校进行实验教学的改革和创新提供方法和依据。生物技术大实验采用集中授课，避免了传统教学方式实验时间分散、学生无法统筹等缺点，更能有效激起学生学习的积极性，提高实验教学效率。菌种的筛选与纯化、菌种培养条件及产酶条件优化、发酵设备的构造及使用、发酵过程的中间分析与控制、发酵浸提液的固液分离与有效成分的初步提取、层析分离和纯化、酶活测定及成品加工等相关技术有机结合，实验过程

3、连贯有序，学生的自主性设计贯穿于实验教学的每个环节，有利于培养学生初步的科研能力，能有效促进学生整体观、综合设计能力及创新能力的培养与提高。希望通过本实验课程的学习，学生的综合应用能力、实验操作技能及创新能力能有一定的提高，并能有效提高学生初步的科研能力。实验目录实验一 枯草芽孢杆菌淀粉酶产生菌的分离与纯化1实验二 枯草芽孢杆菌淀粉酶产生菌的发酵条件7实验三 发酵浸提液的固液分离及有效成分的初步提取12实验四 淀粉酶的层析分离和纯化15实验五 -淀粉酶的酶活性质研究 20附表 23实验一 枯草芽孢杆菌淀粉酶产生菌的分离和纯化一、目的和要求1.掌握常用培养基的配制方法、操作步骤及高压蒸汽灭菌的基

4、本原理和方法。2.掌握微生物的分离、纯化及菌种保藏的基本原理和方法。3.练习微生物接种、移植和培养等基本技术，掌握无菌操作技术。4.了解菌种保藏的基本原理，掌握几种常用的菌种保藏方法。二、基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，混杂生存着大量不同种类的微生物，从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线

5、分离法等方法分离、纯化出该微生物，直至得到纯菌株。需要注意的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不能保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养需要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，这里生活的微生物在数量和种类上都是极其多样的，因此，土壤中的微生物具有较高的丰富度和多样性，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。本实验将采用平板分离法从土壤中分离出-淀粉酶高产菌的枯草芽孢杆菌。三、试验材料1.样品：新鲜土壤2.培养基2.1 平板筛选培养基

6、 蛋白胨 10g、NaCl 5g、牛肉膏 3g、可溶性淀粉 20g、0.01曲利苯蓝 10ml、蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。2.2 斜面培养基 可溶性淀粉 1、蛋白胨 0.5、磷酸二氢钾 0.3、(NH4)2SO4 0.25，调节PH为7.0，121灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。3.溶液和试剂新鲜土壤、蒸馏水、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、可溶性淀粉、稀碘液、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液4.仪器或其它用具无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、微量移液器

7、、移液器枪头、恒温培养箱、无菌工作台、天平、吸耳球、pH计、量筒、试管、三角瓶、玻璃珠、漏斗、分装架、玻璃棒、烧杯、铁丝筐、接种环、酒精灯、牛皮纸、纱布、铁架台、电炉、灭菌锅、干燥箱、水浴锅、冰箱等;四、试验路线称取土样梯度稀释平板筛选分离培养斜面接种菌种保藏五、操作步骤1.实验前的准备1.1 清洗和包裹 玻璃器皿等在灭菌前须进行包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧；吸管用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。 图1-

8、1 吸管灭菌前的包装1.2 干燥箱灭菌 将包扎好的物品放入干燥烘箱内，不要摆放太密，确保空气流通；不得使器皿与烘箱内层底板直接接触。将烘箱温度升至160170并恒温12h，注意勿使温度过高，超过170，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果仅需烤干玻璃器皿，在120恒温30分钟即可。温度降至6070时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。用此法灭菌时，不能使用油、蜡纸包扎物品。1.3 火焰灭菌 直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。1.4无菌水的制

9、备 250mL三角烧瓶（装有20个玻璃珠），装自来水90mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。2.培养基的制备2.1 称量 按培养基配方依次准确称取各药品，放入适当大小的烧杯中，蛋白胨极易吸潮，称量应迅速；牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。2.2 溶化 在烧杯中先加入一定量（约占总量的1/2）蒸馏水，在石棉网上加热搅拌使其溶解，或在磁力搅拌溶解。将药品完成溶解后，补充水到所需总体积。配方中有淀粉，则先将淀粉

10、用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。配制固体培养基，则将所需量的琼脂放入已溶的药品中，再边搅拌边加热溶化，最后补足水分（水需预热）。2.3 调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。2.4 过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，一般无特殊要求情况下，这一步是可以省去的。2.5 分装 过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜，固体分装量为管高的1/5，灭菌后制斜面；分装三角瓶，其

11、装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。图1-2 培养基的分装2.6 加塞 培养基分装完毕，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。图1-3 棉塞的正确制作方法1.正确方法 2.管内部分太短、外部太松 3.外部过小 4.整个棉塞过松 5.管内部分过紧、外部太松2.7 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、组别和配制日期，三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别和配制日期。2.8 灭菌 将内层锅取出

12、，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，放回内层锅，并装入培养基，加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，0.103MPa，121并同时打开排气，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升；当锅内压力升到所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间。20min后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至”0”时，打开排气，旋送螺铨，打开盖子，取出。将取出的灭菌培养基放入37温箱培养。24h，经过检查，若无菌生长，既可待用。2.9 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管口端搁置在玻棒或其它合

13、适高度的器具上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。图1-4 斜面的摆法和冷凝2.10 倒平板 将灭菌后的培养基，于水浴锅中冷却到5560，立刻倒平板，倒平板的方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成

14、平板。最好是将平板放室温2-3天，或37培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。图1-5 倒平板的方法3.-淀粉酶产生菌的分离纯化3.1采土样 选择较肥沃的土壤，铲去土表层，挖520cm深度的土壤数10g，装入灭菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室备用。3.2 制备土壤稀释液 称取土样l0g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇20min，使土样与水充分混合，将菌分散，即为稀释10-1的土壤悬液。取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2

15、、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀释度的土壤溶液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管，在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底。图1-6 土壤稀释液的制备和稀释液的取样3.2 涂布平板 取3个筛选培养基，用记号笔在培养皿底部贴上标签，分别注明稀释度（10-4、10-5和10-6）、组别和班级，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5l0min，使菌液浸入培养基。图

16、1-7 平板涂抹操作3.3 培养 将培养基平板倒置于37培养箱中培养2-3日。3.4 挑菌 观察菌落形态，并计数菌数。选取菌落周围形成明显透明圈的菌株，测量水解圈直径（Dh）与菌落直径（Dc），挑选d/D值较大的进行划线纯化。4.平板划线分离纯化4.1标记 每组取无菌培养皿3付，在皿底贴上标签，标明培养基名称、组别和实验日期。取已熔化的筛选培养基，倒入平皿，制成平板。4.2 划线 划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述分离出的菌株一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。（1）连续划线法：将挑取有样品的接种环在平

17、板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，于37倒置培养48h。图1-8 连续划线法（2）分区划线法：用接种环挑取相应菌液，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，于37倒置培养48h。图1-9 分区划线法4.3 挑菌 观察菌落形态，挑选d/D值大的单菌落再进行划线培养，重复纯化数次，以提高菌落纯度，直至获得纯培养。5.斜面接种操作在超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培

18、养基(菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，斜面向上管口对齐，斜持试管呈450度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。将接种环垂直放在火焰上灼烧，镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，需要彻底灼烧。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上

19、，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。在斜面的正上方距离试管口2-3cm处贴上标签，在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期，于37恒温箱中培养48h。图1-10 斜面接种无菌操作6.纯培养的保存（斜面冰箱保藏法）将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入4冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。图

20、1-11 菌种的保存六、注意事项（1）要确保灭菌彻底，在整个实验过程中应保证无菌操作；（2）高压蒸汽灭菌过程中，注意不要将待灭菌的物品摆放太密，以免妨碍空气流通；灭菌结束后，应待压力降至接近“0”时，才能打开放气阀，过早过急地排气，会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外；（3）制备土壤稀释液的过程中，需使用不同的吸管（可使用微量移液器，稀释过程中更换枪头）。七、实验报告1.实验结果（1）检查培养基灭菌是否完全。（2）观察淀粉酶产生菌的菌落形态，简述菌落的形态特征。（3）分析肥沃土壤中淀粉酶产生菌的数量级一般为多少？（4）所做涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是

21、，请分析其原因并进一步进行分离纯化。（5）斜面培养检验分离纯化效果，保存菌种。2.思考题（1）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养 基是否有污染？（2）在土壤稀释液的制备过程中，逐级稀释的目的是什么？（3）在菌种分离纯化过程中，为什么要把培养皿倒置培养？（4）在平板分区划线中，为什么每次都需将接种环上的剩物烧掉？（5）斜面接种过程中，应该注意哪些事项？（6）纯培养保存的方法有哪些？保存过程中应该注意哪些事项？（7）如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出主要的实验步骤。（8）试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌并进行计数。实验二 枯草芽孢杆菌淀粉酶产生菌的发酵条件一、目的和

22、要求1.掌握紫外分光光度计的工作原理和操作方法；2.掌握-淀粉酶酶活的测定原理和方法；3.掌握微生物生长曲线和产酶曲线的绘制原理和方法；4.了解炭源、氮源、通气量、底物含量、温度、发酵初始pH值等理化因素对芽孢杆菌产酶的影响。二、基本原理1.-淀粉酶活力的测定-淀粉酶能将淀粉链的-1,4葡萄糖苷键切断，使淀粉成为长短不一的短链糊精以及少量麦芽糖和葡萄糖。因此酶反应过程中对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，以颜色消失的速度计算酶活力。2.枯草芽孢杆菌生长曲线的绘制由于细菌悬液的浓度和浊度成正比,因此可以用分光分度计测定菌悬液的OD值来推知菌液的浓度。将种子接入到新鲜的培养基,开始记时,每隔一个小时取

23、5ml样,以未接种的培养基为参照,用分光光度计, 660nm的波长下,测量吸光度,将其和时间建立坐标关系描绘出一根曲线,即为生长曲线。3.枯草芽孢杆菌产酶曲线的绘制 在细菌发酵培养的不同时间取出一定量的发酵液，加入EP管中，离心取上清液，测定酶活，测定结果与时间相关即可得到产酶曲线。4.发酵条件研究环境因素包括物理因素、化学因素和生物因素，培养条件对菌体生长和酶的产生具有重要影响。培养条件优化包括种子种龄和接种量的确定、培养基中炭源和氮源的确定、底物浓度的确定、培养温度以及培养基起始pH值的确定。在产酶发酵过程中，酶的合成是受到一定发酵条件控制的，条件不同，所产生的酶量有很大变化。将炭源、氮源

24、、通气量、底物含量、温度、发酵初始pH值等因素分别作梯度，对芽孢杆菌进行培养，确定芽孢杆菌产生-淀粉酶的最佳培养条件。三、试验材料1.培养基1.1 液体筛选培养基蛋白胨 10g、NaCl 5g、牛肉膏 3g、可溶性淀粉 20g、0.01曲利苯蓝 10ml、蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121灭菌20min1.2 参考发酵培养基黄豆粉 5g、麸皮 10g、可溶性淀粉 2.5g、蒸馏水 1000ml，调节PH为8.8，121灭菌20min1.3 基础发酵培养基蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、NaCl 5g、蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121灭菌20min1.4 不同碳源培养基

25、以蛋白胨为氮源，分别以葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、纤维素、麸皮、蔗糖、甘油和乳糖（浓度均为1）作为碳源替换基础发酵培养基中的碳源配制培养基，调节PH为7.0，121灭菌20min1.5 不同氮源培养基 以麸皮为碳源（浓度为1），以(NH4)2SO4、明胶、NH4NO3、尿素、KNO3、黄豆粉和蛋白胨（浓度均为1）作为氮源替换基础发酵培养基中的氮源配制培养基，调节PH为7.0，121灭菌20min1.6 不同NaCl含量的培养基 以麸皮为碳源、以黄豆粉为氮源（浓度均为1），改变NaCl的含量，分别以0、0.1、0.3、0.5、0.7%、0.9%的含量配制发酵培养基，调节PH为7.0，121灭菌2

26、0min1.7 不同底物含量的培养基 在基础发酵培养基中添加不同量的底物（可溶性淀粉），分别以0、0.25、0.5、0.75、1.0%、2.0%、4.0的含量配制发酵培养基，调节PH为7.0，121灭菌20min1.8 不同初始pH值的培养基 调节基础发酵培养基的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，121灭菌20min2.酶活测定溶液（1）国家行业标准法 原碘液：称取碘化钾22.0g溶于约300ml水中，加入碘11.0g，在搅拌下使其溶解，然后用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中备用（每月制备一次）；稀碘液：称取碘化钾22.0g溶于约300ml水中，准确加入原

27、碘液2.00ml，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中备用（每天制备一次）；2可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉（以绝干计）2.000g，精确至0.001g，用少量蒸馏水调成浆状物，在搅动下倾入70ml沸水中，然后以30ml蒸馏水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热煮沸20min直至完全透明，冷却至室温，用蒸馏水定容至100ml，此溶液必须当天配制；缓冲液（pH6.0）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）45.23g和柠檬酸（C6H8O7H2O）8.07g，用蒸馏水定容至1000ml，配好后应以酸度计校正pH 值为6.0；盐酸溶液0.1ml/L：吸取36的浓盐酸86.2ml，用水溶

28、解并定容至1000ml，制得1mol/L盐酸溶液，稀释10倍后得0.1mol/L盐酸溶液；（2）兰值法A液（0.2mol/L磷酸氢二钠）：称取磷酸氢二钠35.61g用蒸馏水定容至1000ml；B液（0.2mol/L磷酸二氢钠,NaH2PO4H2O）：称取磷酸二氢钠27.6g用蒸馏水定容至1000ml;C液（0.2mol/L pH6.6 的磷酸缓冲液）：取A液375ml和B液625ml混合；1.0可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉（以绝干计）1.000g，精确至0.001g，用少量C液调成浆状物，在搅动下倾入70ml煮沸的C液中，然后以30ml C液分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热煮沸20

29、min直至完全透明，冷却至室温，用蒸馏水定容至100ml，此溶液必须当天配制；0.5mol/L冰乙酸溶液：量取29.15ml冰乙酸，用蒸馏水定容至1000ml；浓碘液（0.15I2-1.5%KI）：称取碘化钾15g用少量蒸馏水溶解，称取1.5g碘加入碘化钾溶液中振荡至碘完全溶解，用蒸馏水定容至1000ml；稀碘液（0.015I2-0.15%KI）量取浓碘液100ml，用蒸馏水定容至1000ml3.试剂蛋白胨、牛肉膏、琼脂、可溶性淀粉、0.01曲利苯蓝、黄豆粉、麸皮、NaCl、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、乳糖、(NH4)2SO4、明胶、NH4NO3、尿素、KNO3、黄豆粉、K2HPO4、KH2P

30、O4、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液、碘化钾、碘、Na2HPO412H2O、柠檬酸、0.1ml/L HCl溶液、NaH2PO4H2O、冰乙酸4.仪器或其它用具无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、微量移液器、移液器枪头、恒温培养箱、无菌工作台、紫外检测仪（分光光度计）、天平、移液管、吸耳球、pH计、量筒、试管、三角瓶、漏斗、接种环、涂布棒、酒精灯、牛皮纸或报纸、纱布、铁架台、电炉、灭菌锅、干燥箱、水浴锅、冰箱等；四、试验路线设置条件梯度发酵培养（设置条件剃度）酶活测定确定最佳培养条件绘制芽孢杆菌生长曲线绘制产酶曲线五、操作步骤1.碳源对产酶的影响以蛋白胨为氮源，分别以葡萄糖、麦芽糖、可

31、溶性淀粉、纤维素、麸皮、蔗糖、甘油和乳糖（浓度均为1）作为碳源替换基础发酵培养基中的碳源进行发酵培养，培养48h后离心取上清液测定酶活，根据实验数据选择对产酶最有利的碳源；2.氮源对产酶的影响以麸皮为碳源（浓度为1），以(NH4)2SO4、明胶、NH4NO3、尿素、KNO3、黄豆粉和蛋白胨（浓度均为1）作为氮源替换基础发酵培养基中的氮源进行发酵培养，培养48h后离心取上清液测定酶活，根据实验数据选择对产酶最有利的氮源；3.NaCl含量对产酶的影响以麸皮为碳源、以黄豆粉为氮源（浓度均为1），选择不同的NaCl加入量进行发酵培养，培养48h后离心取上清液测定酶活，根据实验数据选择最佳NaCl加入量

32、；4.通气含量对产酶的影响用100ml三角瓶分别装10、15、20、25、30ml不同量的发酵培养基接种发酵，培养48h后以上清液酶活大小为指标，测定不同装液量（即通气量）对产酶的影响；5.底物（淀粉）含量对产酶的影响在基础发酵培养基中添加不同量的底物（可溶性淀粉），分别以0、0.25、0.5、0.75、1.0%、2.0%、4.0的含量配制发酵培养基，进行发酵培养，培养48h后以上清液酶活大小为指标，确定发酵培养基中最佳的可溶性淀粉含量；6.温度对产酶的影响100ml三角瓶盛放15ml基础培养基，从斜面接入1环菌体，置于旋转式摇床上，200r/min，分别在15、20、25、30、35、40、

33、45、50进行发酵培养，培养48h后以上清液酶活大小为指标，确定最佳发酵温度；7.培养基初始pH值对产酶的影响调整基础培养基的初始pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，各取15ml加入100ml三角瓶中，从斜面接入1环菌体，置于旋转式摇床上，200r/min，30进行发酵培养，培养48h后以上清液酶活大小为指标，确定最佳发酵培养基初始pH值；8.生长曲线的测定250ml三角瓶盛放50ml种子培养基，从斜面接入1环菌体，置于旋转式摇床上，200r/min，30培养，从0h开始，每隔1h取5ml样，直至48h，以空白培养基做对照，用分光光度计于660nm波长下

34、测定吸光度OD值，将其和时间建立坐标关系描绘出一根曲线,即为生长曲线；9.产酶曲线的测定在细菌发酵培养的不同时间，取出发酵液1.00ml加入1.5ml EP管中，离心取上清，测定酶活，测定结果与时间建立坐标关系描绘出产酶曲线。10.酶活力的测定10.1 国家行业标准法（QB/T 2306-97）（1）酶活定义：在70、pH 6.0条件下，1 min 液化可溶性淀粉1mg所需的酶量，即为一个酶活单位，以u/ml(u/mg)表示。（2）测试方法： 吸取2可溶性淀粉溶液20ml和pH6.0缓冲溶液5ml于试管中。在70恒温水浴中预热平衡5min； 加入稀释好的待测酶液1.00ml，立即用秒表计时，摇

35、匀，准确反应5min； 立即用自动吸管吸取反应液（b）1.00ml于预先盛有0.1mol/L盐酸0.5ml和稀碘液5ml的试管中，摇匀； 以0.1mol/L盐酸0.5ml和稀碘液5ml的混合液作为空白对照，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度（A）。根据吸光度查表，求得测试酶液的浓度（c）。（3）计算方法：X=c×n×16.67其中，X-样品的酶活力（u/ml,u/mg）;c-测试酶液的浓度（u/ml）；n-样品的稀释倍数；16.67-换算倍数。平行实验结果的相对误差不得超过2。10.2 兰值法（1）酶活定义：酶活力（BV）是指在测试条件下使淀粉与碘呈色反应

36、（蓝色深度下降10时所相当的被液化的可溶性淀粉/mg）来表示的。（2）测试方法： 量取1.0的可溶性淀粉溶液（用缓冲液配置）100ml入摇瓶，在70下保温10min； 吸取酶液1.00ml加入预热淀粉溶液中，摇匀，计时反应30min； 吸取0.5mol/L冰乙酸溶液10ml加入反应体系中终止反应； 吸取终止反应液1.0ml加入10ml稀碘-碘化钾溶液中摇匀，于660nm波长下，用分光光度计测定吸光值OD1； 以蒸馏水代替酶液重做上面的测试步骤，所得吸光值为OD0。（3）计算方法：BV=(OD0- OD1)/ OD1×S×N×100/10其中，S-反应体系中的点分量

37、（mg）;N-酶液的稀释倍数； OD0-空白吸光值；OD1-样品的吸光值。六、注意事项（1）接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器 皿上，以免造成污染；如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净（2）凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内；（3）配制可溶性淀粉溶液必须用沸水或煮沸的缓冲液进行配制，煮 沸溶解成透明或半透明的液体，否则不能与碘结合成紫兰色的复合物；（4）吸取酶液时尽量取澄清后的上清液，因为粗提物中含有大量的不溶性杂质，这些杂质在高温作用下会干扰淀粉与碘的显色反应，使溶液不变蓝；七、实验报告1.实验结果（1）记录发酵过程中观察到的现象；（2）测定

38、不同炭源、不同氮源发酵培养基发酵产物的酶活，并列表记录，确定最佳炭源和氮源；（3）测定不同NaCl含量发酵培养基发酵产物的酶活，并绘制NaCl添加量与产酶关系曲线，确定最佳NaCl含量；（4）测定不同装液量下发酵产物的酶活，并绘制装液量与产酶关系曲线，确定最佳通气量（装液量）；（5）测定不同底物含量发酵培养基发酵产物的酶活，并绘制淀粉添加量与产酶关系曲线，确定最佳底物含量；（6）测定不同发酵温度下发酵产物的酶活，并绘制发酵温度与产酶关系曲线，确定最佳发酵温度；（7）测定不同初始pH值发酵培养基发酵产物的酶活，并绘制初始pH值与产酶关系曲线，确定发酵培养基最佳初始pH值；（8）绘制枯草芽孢杆菌的

39、生长曲线和产酶曲线；2.思考题（1）-淀粉酶酶活力测定中应注意哪些因素？（2）试讨论在发酵过程中都是有哪些因素会影响枯草芽孢杆菌的生长及产酶情况？（3）试设计一个实验，确定嗜碱芽孢杆菌支链淀粉酶产生菌的最适产酶条件。实验三 发酵浸提液的固液分离及有效成分的初步提取一、目的和要求1.熟悉发酵罐的结构特点及操作方法；2.掌握发酵浸提液的固液分离的操作步骤和工作原理；3.掌握盐析法初步分离纯化蛋白质的原理和方法；4.掌握透析脱盐浓缩蛋白质的原理和方法。二、基本原理1.蛋白质的盐析蛋白质是亲水胶体，借水化膜和同性电荷（在PH值7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷）维持胶体的稳定性。由于蛋白质分子内及分子间

40、电荷的极性基团有着静电引力，当向蛋白质溶液中加入少量碱金属或碱土金属的中性盐类如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大，因此蛋白质、酶等在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，此时称为盐溶；当盐浓度不断上升并达到一定浓度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。由盐析所得的蛋白质沉淀，经过透析或用水稀释以减低或除去盐后，能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性，因此由盐析生成的沉淀是可逆性沉淀。盐

41、析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。2.透析脱盐的原理蛋白质的分子很大，其颗粒在胶体颗粒范围（直径1100nm）内，不能透过半透膜。选用孔径合宜的半透膜，使小分子物质能够透过，而蛋白质颗粒不能透过，这样就可使蛋白质和小分子物质分开。把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的两端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。这种方法可除去和

42、蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质，是常用来纯化蛋白质的方法。透析需要较长时间，常在低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。三、试验材料1.培养基1.1 种子培养基KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.03%， FeSO4 0.01%，MnSO4 0.01%，CaCl2 0.02%，蛋白胨0.2%，麦芽糖0.1%，可溶性淀粉0.25%，用HCl 调pH为 3.5；1.2 发酵培养基与种子培养基相同；2.酶活测定溶液 参照实验二3.试剂蛋白胨、牛肉膏、KH2PO4、可溶性淀粉、MgSO4、FeSO4、NaCl、麦芽糖、(NH4)2SO4、NaOH、HCl、碘化钾、碘、Na

43、2HPO412H2O、NaH2PO4H2O、PEG6000、柠檬酸、冰乙酸、碳酸钠、Na2·EDTA、EDTA4.仪器或其它用具5L发酵罐、无菌吸管、微量移液器、移液器枪头、透析袋、恒温培养箱、摇床、紫外检测仪（分光光度计）、离心机、分析天平、pH计、量筒、三角瓶、分装架、记号笔、纱布、酒精灯、灭菌锅、干燥箱、恒温水浴锅等；四、试验路线发酵罐发酵培养粗酶液制备硫酸铵盐析透析脱盐浓缩浓缩酶液酶活测定；五、操作步骤1.菌株发酵孢子悬浮液接入种子培养基摇瓶培养24h，10% 的接种量接种到发酵培养基，37，180r/min，培养48h；2.粗酶液的制备发酵液经4层纱布过滤，过滤液在8000

44、r/min离心20min，收集上清液即为粗酶液（测定酶活）；3.硫酸铵盐析3.1 盐析条件的确定1）发酵液上清分装至4支离心管中，每管4 ml； 2）加硫酸铵至4支离心管中，使其饱和度分别为20%、40%、60%和80%。在加硫酸铵时需缓慢的加入，同时不断的摇晃离心管使硫酸铵完全溶解； 3）40静置4h； 4）离心，分别取四支离心管中的沉淀，测量-淀粉酶活性。3.2 盐析 1）上清液中缓慢加入硫酸铵至40%饱和度； 2）4静置4h后，8000r/min离心30min，除去部分杂质蛋白，收集上清； 3）上清液中继续缓慢加入硫酸铵至80%饱和度； 4）4静置4h后，8000r/min离心30min

45、，弃上清液，得沉淀。4.透析脱盐浓缩4.1 透析膜前处理透析袋的预处理方法1：1）戴手套把透析膜剪成适当长度，浸在蒸馏水中 15 min 泡软。2）浸入 10 mM 碳酸钠中，并加热至80，一边搅拌至少30 min。3）换到 10 mM Na2·EDTA 中浸泡 30 min，以新鲜的 EDTA 同样方法处理三次。4）再用 80 蒸馏水洗 30 min，然后换到 20% 酒精中，放在 4 冰箱中保存。透析袋的预处理方法2：1）将透析袋剪成合适的长度；2）在一只250 mL的玻璃烧杯中，加入200 mL的透析袋处理液，微波炉中预热；3）将透析袋装入其中，电炉上煮沸10 min；4）用蒸

46、馏水彻底洗涤；5）蒸馏水中煮10 min；6）冷却后4存放，存放过程中透析袋应完全放入0.01mol/L醋酸缓冲液（pH5.0）中；7）使用前用0.01mol/L醋酸缓冲液（pH5.0）清洗透析袋内外；4.2 操作沉淀物溶于含0.5% NaCl 的0.01mol/L醋酸缓冲液（pH5.0）中，经透析膜袋在20倍量的0.01mol/L醋酸缓冲液（pH5.0）中在4，24h透析脱盐后，在20倍量的30%PEG6000中浓缩收集，冷藏备用。5.酶活力的测定参照实验二中的酶活测定。六、注意事项（1）硫酸铵饱和度计算及加入方式：在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度为100%。用硫酸铵

47、盐析时常用溶液饱和度调整方法有2种。一种是当蛋白质溶液体积不大所需调整的浓度不高时，加入饱和硫酸铵溶液。配制法是加入过量的硫酸铵，热至5060保温数分钟，趁热滤去沉淀，再生0或25下平衡12天，有固体析出时即达100%饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算： S2 - S1V=V0- 1 - S2式中V及V0分别代表所需饱和硫酸铵溶液及原溶液体积，S2和S1分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于2%，可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加固体硫酸铵，其加入量见附表。

48、（2）清洗透析袋内外时，操作过程中应使用镊子或戴手套；（3）蛋白质溶液用透析法去盐时，正负离子透过半透膜的速度不同。以硫酸铵为例，NH4的透出较快.在透析过程中膜内SO42-剩余而生成H2SO4，而使膜内蛋白质溶液呈酸性，足以达到使蛋白质变性的酸度，因此在用盐析法纯化蛋白质做透析去盐时，开始应用0.1M的NH4OH透析，或者用缓冲液配制蛋白溶液。七、实验报告1.实验结果（1）记录发酵过程中观察到的现象；（2）测定粗酶液酶活；（3）记录硫酸铵盐析及透析脱盐及浓缩的操作方法及实验结果；（4）测定透析后酶液的酶活力；2.思考题（1）本实验中硫酸铵饱和度的调整应选用哪种方法方法，为什么？（2）透析时应

49、注意什么才可达到尽量除去盐类，并防止蛋白质变性？（3）透析时可否维持蛋白质溶液的体积不改变？（4）在进行蛋白质透析时，为什么要用醋酸缓冲液溶解蛋白沉淀进行透析，而不用蒸馏水进行透析？实验四 淀粉酶的层析分离和纯化一、目的和要求1.掌握层析法分离纯化蛋白溶液的原理和方法；2.掌握蛋白质分离纯化的方法及其应用；3.学习和掌握SDS-PAGE垂直板型电泳的基本原理和操作技术；4.掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的实验技术；二、基本原理1.层析分离原理层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的

50、成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层，凝胶周围的水为外水层。控制

51、交联度以形成不同孔径的网状结构。交联度小的孔径大，交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入，相对分子量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的空隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；相反，相对分子量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下推移过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流程增长，移动速率慢而最后流出层析柱，而中等大小的分子，他们液能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱，这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子量大小大致分离成

52、不同的区带。选择不同规格的凝胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。2.蛋白质凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene- bisacylamide,简称Bis）在化学催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate,简称AP）和加速剂四甲基乙二胺（N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine,简称TEMED）的作用下聚合交联成三维网络状结构的凝胶。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，SDS是一种阴离子表

53、面活性剂，在电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质-SDS复合物都带上了相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，因此，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎何以忽略不计。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率就可在标准曲线上求得分子量。三、试验材料1.常用贮存液（1）透析袋处理液：碳酸氢钠4g，EDTA 0.0744g溶解于200ml去离子水中；（2）凝胶层析洗脱液：称取12.

54、11g三羟甲基氨基甲烷（Tris），一边搅拌一边加入到800ml去离子水中，然后以pH计实时检测溶液pH值，用浓盐酸调pH至5.8，用去离子水定容至1000ml。（3）SDS加样缓冲液：称取1.5g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入到84ml水中，用浓硫酸小心将pH值调至6.8，再加入40g甘油和0.02g溴酚兰以及6ml的2-巯基乙醇，4存放；（4）分离胶缓冲液：称取18.2g Tris，0.4g SDS，溶解在90ml重蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，加重蒸水至100ml；（5）浓缩胶缓冲液：称取6.0g Tris，0.4g SDS，溶解在80ml重蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，加重

55、蒸水至100ml；（6）电极缓冲液：称取30.3g Tris，144g甘油和10g SDS，溶解在1L重蒸水中，室温存放，用前用重蒸水作1：10稀释；（7）0.1%考马司亮兰染色液：称取0.5g考马司亮兰R-250，溶解在250ml的甲醇中，后加入去离子水200ml、冰醋酸50ml；（8）SDS-PAGE电泳脱色液：甲醇100ml与醋酸75ml以及825ml去离子水混溶；（9）30%丙烯酰胺贮液：称取丙烯酰胺30g，双叉丙烯酰胺0.82g，溶解在双蒸水中，至100ml，于4保存；（10）10%SDS：10g SDS，加水定容至100ml，完全溶解后室温保存；（11）10%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵，加1ml蒸馏水溶解（现配）；2.酶活测定溶液参照实验二3.试剂可溶性淀粉、碳酸氢钠、EDTA、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、浓盐酸、浓硫酸、甘油、溴酚兰、2-巯基乙醇、十二烷基苯磺酸钠（SDS）、考马司亮兰R-