鲍曼不动杆菌疫苗的研究进展.docx

1、.综述.鲍曼不动杆菌疫苗的研究进展郭三君综述,谢勇恩审校川北医学院免疫与分子生物学研究室，四川南充637007摘要:鲍曼不动杆菌为不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性杆菌，同时也是医院获得性感染的主要致病菌之一。由于其广泛的耐药性，普通抗生素对其治疗效果已不明显。近年来，国内外学者尝试通过研制抗菌疫苗的尹段来防治鲍曼不动杆菌感染，主要有灭活全菌体疫苗、外膜囊泡、重组蛋白亚单位疫苗、英膜多糖候选疫苗、联合疫苗等。现就鲍曼不动杆菌疫苗的研究进展进行了综述。关键词:鲍曼不动杆菌;灭活全菌体疫苗;外膜囊泡;重组蛋向亚单位疫苗;英膜多糖候选疫苗;联合疫苗中图分类号：R378.99文献标志码：A文童编号：10

2、05-5673(2017)06-0075-05DOI：10.13309/ki.pmi.2017.06.013ProgressinAcinetobacterbaumanniivaccineGUOSan-jun,XIKYong-enResearchLaboratoryofImmunologyandMolecularBiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637007,SichuanProvince,ChinaCorrespondingauthor:XieYong-en,E-mail:cbyxyeO369Abstract:Acinetobacterbai

3、unannii(AB)isoneofthemostcommongram-negativebacteriainacinetobacterandoneoftheopportunisticpathogenscausedhospitalinfection.Becauseofitswiderangeofdrugresistance,lhetreatmentefficacyisnotsoefficientbycommonlyusedbroad-spectrumantibiotics.Manyresearcherstrytostudyand(levrl(ipvaccineincontrolofABinfec

4、tion,includinginactivedwholecellvaccine,outmembranevesiclesvaccine,recombinantproteinsubunitvaccine,capsularpolysaccharidecandidatevaccineandcombinedvaccine.ThisarticlesummarizedthenewprogressinthestudyofABvaccine.Keywords:Acinetobacterbaumannii(AR)；Inactivedwholecellvaccine；Outmembranevesicles；Reco

5、mbinantproteinsubunitvaccine；Capsularpolysaccharidecandidatevaccine；Combinedvaccine鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)为一种非发酵的革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。近年来,AB越来越多地引起医院感染暴发，如呼吸机相关性肺炎、菌血症和尿路感染，特另I是在重症监护病房(intensivecareunit,ICU)中更常见，这些感染不仅延长住院时间,严重时还可导致病人死亡UF。因该菌对湿热、紫外线及化学消毒剂有较强抵抗力，常规消毒剂只能抑制其生长，而不能将其杀灭,加之在抗

6、生素的选择压力下，不可避免地产生大扯多耐药菌株，这些耐药菌株已成为当前医院感染的棘手问题，亟需寻求新型治疗药物或其他干预措施来对抗这种细菌I】。由于新的抗生素研制缓慢，而AB耐药性发展迅速,研制安全高效的AB疫苗，是有效防治AB感染的新途径。因此，现就AB疫苗的研究进展综述如下。作者简介:郭三君(1990)，女，在读硕士研究生，主要从事鲍显不动杆菌亚单位疫苗研究。通信作者：谢勇恩，教授，E-mail：cbyxye03691灭活全菌体疫苗灭活全菌体(inactivedwholecell,IWC)疫苗是对病毒或细慎进行培养，用加热或化学试剂(如福尔马林)将其灭活，但保留其抗原性而制备的疫苗。有研究

7、表明,AB的IWC疫苗动物免疫接种后，能有效预防AB的攻击感染66】。SHU等测试一种来自抗生素暴露的多重耐药(multidrug-resistant,MDR)AB(I-M28-47-II4)的IWC疫苗，并与相同MDRAB株的灭活非抗生素暴露的IWC疫苗(I-M28-47)相比，以确定这种新开发的候选疫苗是否可增强对AB的保护性免疫力，特别是针对MDR株。结果表明，与I-M28-47接种相比，接种I-M28-47-114刺激产生了更强的免疫应答，同时还介导了对MDRAB更好的清除或杀菌作用。据文献5-8报道,MCCONNEII和KUOLEE等通过制备IWC对小鼠的主动和被动免疫，也获得了较好

8、的免疫保护效应。IWC疫苗具有将细菌的多种抗原呈递给免疫系统的优点，使用抗生素暴露的IWC疫苗能刺激产生更强的免疫应答，同时有望解决AB多重耐药的问题。1WC疫苗还具有制备相对容易，且成本低廉等优点，但其蛋白成分复杂，安全性问题仍需解决。2外膜囊泡外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)是由大最致病性革兰阴性细菌细胞包膜所释放的直径20-200nm的球形囊泡'，由外膜蛋A(outermembraneprotein,Omp)、周质蛋白及一系列与宿主组织粘连、侵袭有关的毒性因子组成“°),其中外膜蛋白包括0mpA、0mpC、0mpF等,周质蛋白包括AcrA

9、和碱性磷酸酶。OMVs已被证实参与DNA片段、自溶素、细胞毒素、毒力因子和其他生物分子的转移，可在细菌发病机制中起重要作用""'KWON等顷研究表明，AB的临床分离菌株在休外生长过程中分泌了OMVs。MCCONNELL等*首次使用ABOMVs制备疫苗免疫小鼠，检测到高滴度血清特异性抗体IgM和IgG,同时检测到IgG亚型IgGlJgG2c,提示ABOMVs同时激活了Th2和Thl免疫途径。分别使用AB标准萌株ATCC19606.临床分离菌株AB-154及泛耐药临床分离株AB113-16攻击OMVs免疫的小鼠，结果发现,OMVs免疫小鼠脾脏细菌载量较对照组明显下降，血

10、浆炎症细胞因子(IL-lJL-6)含量亦明显低于对照组，小鼠存活率高达90%100%,6OMVs虽能诱导产生较强的免疫保护性，但由于其制备过程繁琐，包含大量的细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)，且来源于不同菌株的OMVs,其抗原异质性较大,交叉免疫保护效应较弱，使其临床应用价值具有很大的局限性。3重组蛋白亚单位疫苗AB重组蛋白亚单位疫苗具有成分单一、重复性好，易于控制细菌内毒素含量等优点，在动物体内的研究取得了较好的免疫效果，为研制安全高效的预防感染或治疗性疫苗奠定了基础，是目前国内外学者研究的热点。目前研究较多的AB重组蛋白亚单位疫苗主要包括:三聚体自转运蛋白、生物

11、膜形成相关蛋白和外膜核酸酶等。随着研究的不断深入，-些新的蛋白亚单位疫苗候选靶分子也被陆续发现,如外膜蛋白(FilF、Omp22、OmpK,、Fkib、Omppl及OmpW等)。3.1三聚体自转运蛋白AB三聚体自转运蛋闩(trimcricautotransporterprolein,Ata)是一种表面自体转运蛋白，与细胞外基质/基膜蛋白结合并有助于生物膜的形成，同时它还介导了AB对IV型固定化胶原的黏附及致病力的形成BENTANCOR等时制备了重组Ata蛋白的抗体.结果显示，抗Ata抗体具有产生抗黏、杀菌、调理吞噬和抵抗AB攻击感染的能力，表明Ata可作为AB亚单位疫苗研究的重要候选靶分子。3

12、.2生物膜形成相关蛋白生物膜形成相关蛋白(biofilmassociatedprotein,Bap)是一种在革兰阴性和革兰阳性细菌生物膜形成过程中起重要作用的高分子多结构域蛋白'旻冲。生物膜形成被认为是AB的重要致病特征，特别是在呼吸机相关性肺炎和导管相关尿路感染的情况下，它有利于细菌在恶劣环境中存活2打。ab307-0294萌株的Bap蛋白包含8621个氨基酸，是迄今为止最大的细菌蛋白质之一，也是酸性最强的细菌蛋白质之一(等电点为2.9)Nf),其分子结构中包含多个串联的重复区域，大小从70至104个氨基酸不等。通过对数百种菌株分析发现,ABBap具有高度多态性，中央重复区域具有多样

13、化的结构，重复单元的类型和数量在不同曲株中存在差异。AB对不同抗生素类的耐药性主要由Bap介导，所以制备Bap疫苗至关重要SEFID1等心将铜绿假单胞菌鞭毛蛋白N末端基因(-terminalregionofPseudomonasaeruginosaflagel-lin)与拥有Bap保守区域的pET28a(+)载体相连接,形成重组体,并导入E.coliBI21(DE3)中表达、分离、纯化得到重组蛋白；再用重组蛋白免疫小鼠.显示鞭毛蛋白增强了B叩的免疫原性，导致血清特异性抗体IgG滴度增加;进行AB攻击后，用重组蛋白免疫的小鼠存活率为80%,实验组内脏器官(如肝脏、脾、肺)带菌量低于对照组。这种以

14、细菌鞭毛蛋白作为Bap疫苗佐剂的免疫方案可为AB疫苗的研究提供参考。3.3外膜核酸酶外膜核酸酶(outermembranenu-clease)是AB外膜中的-种蛋白质，由于其具有核酸酶活性，因而被称为外膜核酸酶。革兰阴性细菌和革兰阳性细菌均能产生外膜核酸酶，可能与细菌致病力及在恶劣环境中存活有关。据报道，当人体处于感染期时，血清中可检测到抗核酸酶抗体,且这种抗体在临床上也可用于疾病的诊断营-扪。GARG等首先利用生物信息学软件对AB外膜核酸酶的分子结构进行分析，发现其具有候选疫苗分子的所有特征，如外膜定位、高黏附素概率(0.53)、仅有一个跨膜螺旋结构、与人类蛋白质同源性极低、有多个人白细胞抗

15、原(humanleukocyteantigen,HLA)限制性的T、B细胞识别表位等。分析40株临床分离的AB菌株发现,其外膜核酸酶同源性达100%o进一步利用PCR扩增外膜核酸酶基因，经克隆表达、提取并纯化，得到相对分子质量为90000的重组蛋白，用完全/不完全福氏佐剂乳化重组蛋白后免疫小鼠，在第一次加强免疫后即收获高滴度(>10')的抗体，表明外膜核酸酶具有很强的免疫原性,能诱导良好的免疫应答，且促炎因子(IL-6和TNF-a)水平明显降低，而抗炎因子(IL-10)明显升高。同时将收获的抗血清免疫小鼠再给予小鼠致死剂量的AB攻击感染，发现小鼠存活率达40%。外膜核酸酶是一种外

16、膜蛋白，具有很强的免疫原性、只有一个跨膜螺旋，便于重组表达和纯化，与人/鼠蛋白同源性极低,可有效的避免自身免疫，与其他候选疫苗相比具有较大的优势-30】，但仍需进一步从多方面来评估外膜核酸酶的免疫保护作用，如对其他动物模型(败血症)、动物物种以及接种剂量等进行研究。3.4新发现的蛋白亚单位疫苗候选耙分子FilFFilF是AB中一种未知功能的外膜蛋白。SINGH等】研究发现，在AB标准菌株ATCC19606中有一种外膜非特异性的假定菌毛装配蛋白，将其命名为FilF。该蛋白含有641个氨基酸,其中有20个氨基酸是定位于外膜的信号肽。PCR扩增FilF基因，构建重组质粒PET-28a-FilF导入E

17、.coliBL21(DE3)中表达、提取并纯化，得到FilF重组蛋白与佐剂组成的疫苗，经皮下注射免疫小鼠，能诱导特异性抗体IgG的产生(抗体滴度>64000),并明显降低促炎因子(IL-6和TNF-a)的水平，给予致死剂量的AB攻击感染，小鼠肺组织细菌载量比对照组明显降低，小鼠存活率达50%,表明FilF具有抗AB感染的免疫保护作用。3.4.1 Omp22Omp22是从ABOMVs中发现的相对分子质量为22350的一种外膜蛋白，故命名0mp22oHUANG等&研究发现，在AB不同菌株之间Omp22同源性高达95%,是一种具有高度保守性的抗原蛋白。用不同剂量的Omp22重组蛋白免疫

18、小鼠，发现实验组不仅检测到高滴度的IgG抗体，其抵抗AB攻击的能力亦大大增强,攻击后24h小鼠存活率达100%,此时对照组小鼠已全部死亡。在细胞毒性试验方面，显示ABOmp22蛋向对A549和293FT细胞仅有轻微的增殖抑制作用，几乎不存在毒性。在这项研究中Omp22被证实具有高度的保守性、较强的免疫原性和免疫保护性。因此，它是一种有希望的抗原靶分子,可用于AB疫苗的进一步研究。3.4.2 OmpK、Fkib和Omppl研究发现，14个AB基因组序列中，有2752个同源的核心基因。利用蛋白质组学信息和生物信息学等技术筛选出13个蛋白为候选疫苗分子靶标，最后选择并克隆了3个抗原基因(OmpK、F

19、k原、Omppl)o分别用重组OmpK,Fkib和Omppl蛋白免疫小鼠后，能够检测到高滴度的特异性抗体，在AB攻击试验中,对小鼠AB肺炎模型起到了不同程度的保护作用3】。3.4.3 OmpWOmpW也是一种未知其功能的蛋白质。HUANG等在AB标准菌株ATCC17978外膜上发现一种含有183个氨基酸的外膜蛋白OmpW,其在不同菌种之间的同源性达到91%0重组OmpW的主动免疫和被动免疫均能有效的保护小鼠免受AB的感染，但用纯化的OmpW蛋白与肺腺癌细胞(A549)及人胚肾细胞(293FT)共同孵育，发现其对两种细胞均有不同程度的增殖抑制作用。提示OmpW毒性太强,而使其成为候选疫苗靶分子的

20、可能性大大降低，其毒性作用的机制还有待进一步研究。4荚膜多糖候选疫苗荚膜多糖(capsularpolysaccharide)具有作为疫苗候选分子的诸多特征，如广泛暴露于细菌表面，可刺激宿主产生保护性免疫反应,在细菌的侵袭和致病中起重要作用以YANG等地研究发现,AB临床菌株SK44与ATCC17978菌株荚膜多糖生物合成相关基因位点,在核甘酸水平上具有99%的一致性，而相关锚定蛋白的同源性超过95%；将SK44菌株的荚膜多糖与TiterMax佐剂按1:1的比例混匀后，通过微创手术的方法注入新西兰大白兔的脾脏，收获抗血清，显示ABSK44菌株的荚膜多糖抗体具有较强的免疫保护性;免疫斑点试验显示，

21、在554株临床分离的AB菌株中有62%能与SK44荚膜多糖抗体发生反应，表明其对异源菌株有交叉保护的可能性°此外,AB307-0294菌株的K1荚膜多糖也被作为疫苗候选分子进行了研究。RUSSO等】研究发现,AB307-0294菌株的K1荚膜多糖没有引起人体自身免疫反应的交叉表位。用纯化后的K1荚膜多糖肌肉免疫CD1小鼠,检测结果显示K1荚膜多糖具有明显的免疫原性。使用针对AB的K1荚膜多糖的单克隆抗体(monoclonalantibody,MeAb)13D6来确定100株AB菌株的K1荚膜多糖的血清阳性率，结果显示,收集的AB分离株中有13%对13D6血清反应阳性。在嗜中性粒细胞介

22、导的杀菌试验中，与K1荚膜多糖表达阴性的菊株相比，13D6可明显增强中性粒细胞对K1荚膜多糖阳性菌株的杀菌活性。在大鼠软组织感染模型中，分别用ABK1阳性菌株和K1阴性菌株进行攻击，在细菌攻击24h后，用13D6进行治疗，检测到两种菌株的菌落形成单位（colony-formingunits,CFU）o与对照组相比，用McAbl3D6治疗显著降低AB3O7-O294（K1阳性菌株）的生长/存活率，与AB979（K1阴性菌株）相比则不受McAhl3D6治疗的影响，即英膜多糖的抗体对ABK1阳性菌株感染具有潜在治疗效果。虽然针对不同的血清型可能需要制备相应的特异性抗体,但面对日益增多的耐药菌株，以荚

23、膜多糖为靶点的被动免疫治疗仍可为AB的防治带来希望。5联合疫苗将多种抗原组分联合运用或将OMVs与重组外膜蛋白疫苗联合运用形成联合疫苗，可能是提高AB候选疫苗免疫效应的策略之一。BADMASTI等叫将AB外膜囊泡OMV和重:组Bap（17M）联合免疫小鼠，结果显示，小鼠体液和细胞免疫反应被同时激活，产生了充分的免疫保护效应；与OMV或Bap”#）单独免疫组相比，联合免疫组小鼠受到AB攻击感染后的存活率显著提高，脾组织细萌载量明显低于QMV或Bap（M5）单独免疫组，表明多组分候选疫苗联合免疫，能更有效地激活Thl和Th2免疫应答,为小鼠提供更强的免疫保护作用。6结语在有限的药物选择和高死亡率面

24、前，治疗耐药AB感染而临严峻挑战3。接种疫苗是最有效的感染控制措施之一网】。目前由于生物信息学、基因组学、分子生物学、蛋白组学等技术的快速发展，大大促进了AB疫苗的研究，从早期的灭活全菌疫苗到最新的利用反向疫苗学方法筛选靶抗原，给我们更加有针对性地研究抗AB的疫苗带来了希望。目前，多个研究证明：IWC疫苗和OMVs疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性，其免疫的小鼠均能抵抗AB的感染和侵袭，但由于其存在灭活不全及内毒素残留等缺点，致使不能被安全而广泛的应用。因此，人们把研究的热点转向AB的亚单位疫苗。虽然亚单位疫苗避免了灭活不全带来的安全问题，但单个重组蛋白构成的亚单位疫苗可能存在免疫保护不足，交

25、叉免疫保护作用不强等缺点，因此,探讨将多种候选蛋白分子联合使用，并设计合理免疫方案，或研制包含多个优势抗原表位的多亚单位疫苗，是今后研究的重要方向。由于AB基因组及抗原表位存在一定的多样性和不稳定性，构建抗原覆盖率广、结构完善、产生高效价抗体和免疫保护效应疫苗的任务依然十分艰巨，仍需不断地探索和深入研究。参考文献G0NZALEZ-V1LL0IUAAM,VALVERDE-GARDUNOV.Antibiotic-resistantAcinelobaciertiaumanniiincreasingsucceMremainsachallengeasanosocomialpalhogenJj.JBath

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