质粒DNA提取及纯化.罗云鹏

1、2016DNA的提取和纯化小量制备大量制备碱裂解小量制备法氯化铯/溴化乙锭平衡力新法碱裂解法制备粗制裂解物煮沸小量制备法名词解释1.质粒质粒zhl（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler（天蓝色链霉菌）等放线菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋体）等原核生物中，又相继发现线形质粒。2.基因工程基因工程（genetic engineer

2、ing）又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。溶液一50mmol/L葡萄糖 ，25mmol/L Tris-Cl10mmol/LEDTATris-ClT

3、ris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25），中文别名：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷；Tris，英文名称：Tris(hydroxymethyl)aminomethane分子式：C4H11NO3分子量：121.14CAS号：77-86-1密度：1.353熔点：167-172沸点：219-220 (10 mmHg)闪点：100水溶性：550 g/L (25)外观：白色结晶 水溶性：无色，澄清毒性：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。用途Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。Tris缓冲液的低离

4、子强度特点可用于线虫（C. elegans）核纤层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的PH。此外，Tris还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。Tris也被用作滴定标准物。 作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。苏宁易购宝宝知道拇指医生百度知道首页 电脑版 反馈词条由网民创作并享有版权，请保护版权归属了解更多Tris-HCl 用百度知道词条目录百科名片概述简介用途EDTA溶液乙二胺四乙酸能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二

5、价金属离子结合的一种螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂；也可用于去除重金属离子对酶的抑制作用。用途EDTA是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添加剂，血液抗凝剂，洗涤剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性络合物。溶液一的作用溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl,pH=8.0葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性

6、.这一步溶液中还可以加入RNase,不受EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去溶液二200mmol/LNaOH1/100SDS(临用前配置)SDSSDS（全称为sodium dodecyl sulfate,sodium salt）是一种化学品，中文名为十二烷基硫酸钠。主要成分： 纯品外观与性状： 白色粉末。理化熔点()： 204-207沸点()： 无资料相对密度(水=1)： 1.09溶解性： 溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。主要用途： 用作洗涤剂原料、印染工业的匀染剂、矿物的浮选剂。还可作为表面活性剂，起到助溶作用。溶液三由醋酸以及钾盐所形成，前者在于中和碱性，后者有利于染色体DNA的沉淀

7、。质粒是一种独立于染色体DNA之外的能自主复制的双链，闭合，环装小分子的DNA ，其大小范围从1kb200kb以上不等。广泛存在于细胞中，在一些动，植物细胞中也发现有质粒的存在。目前提纯质粒的方法比较多，如碱裂解法，煮沸法和SDS法等。最常用的是碱裂解法，其优点为效率高，价廉简单易学等。碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与变性与质粒DNA的复性的差异而达到分离的目的。在PH12.012.6的碱性环境中，宿主的染色体DNA变性（是氢键断裂，破坏碱基配对），蛋白质变性。质粒DNA的碱基对也被破坏，闭环的DNA链处在缠绕状态而不能彼此分开。加入乙酸钾缓冲液中和后，PH调至中性，小分子的变性质粒D

8、NA迅速复性为可溶状态，而变性的染色体DNA因分子量巨大而难以复性，随同高分子量RNA以及K+/SDS/蛋白质/膜复合物形成沉淀，故经离心，即可将染色体DNA和质粒DNA分离。在实验步骤中，加入溶解液1的目的主要是将细菌团块重新悬浮于缓冲溶液中。溶液2含有SDS和NaOH，前者可将细菌溶解，后者可将DNA变性。溶液3由醋酸及钾盐所形成，前者在于中和碱性，后者则由于DNA的沉淀。加入溶液3后离心，大部分蛋白质和染色体DNA沉在下面，而上清液中所含的质粒DNA可继续进行纯化。纯化质粒采用氯化锂沉淀和聚乙二醇沉淀的方法。进一步用RNA酶消化可去除残余的RNA。用酚：氯仿：异戊醇抽提可除去PEG和残余

9、的蛋白质。在经乙醇沉淀和离心回收，即可得到高度纯化的质粒DNA。制备的质粒DNA可用于酶切，连接，转化，以及PCR等。质膜微囊通常直径约50-100nm，富含胆固醇、鞘磷脂（sphingomyelin）和鞘糖脂（glycosphingolipids），并形成一个去垢剂不溶性的膜区域，以存在caveolin蛋白分子为特征。质膜微囊大量存在于内皮细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、纤维母细胞和肺上皮细胞。随着分子生物学研究的进展，发现质膜微囊参与许多细胞生命活动，例如细胞内吞（endocytosis）、胆固醇运输、细胞膜组装、信号传导和肿瘤生成，并参与许多致病性细菌和病毒的内吞过程。恒温摇床 普通离心

10、机 台式高速离心机 漩涡振荡器 -20度冰箱 三角烧瓶 烧杯 量筒 刻度吸管 制冰机 Eppendorf管架 Tip头 保温瓶 可调式移液器（020ul,0200ul,201000ul） 试管架 纸巾或吸水纸(1)溶液一：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl(PH=8.0),10mmol/LEDTA(2)溶液二：200mmol/LNaOH,1/100SDS(临用前配制)(3)溶液三：5mmol/L乙酸钾，冰乙酸，水按6:1.15:2.85混合而成，所配溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是 5mol/L(4)STE溶液：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl(P

11、H=8.0),1mmol/LEDTA(5)TE缓冲液：10mmol/LTris-Cl(PH=8.0),1mmol/LEDTA(6)3mol/L乙酸钠(PH5.2)(7)5mol/LiCl(8)1.6mol/L NaCl ,13/100PEG：将3.9g聚乙二醇溶于20ml1.6mol/LNaCl中，再加1.6mol/LNaCl定容至30ml过滤除菌，置4摄氏度保存。(9)饱和酚(10)氯仿：异戊醇(24:1) (11)RNnase A溶液(10mg/ml),无水乙醇，异丙醇(12)LB培养基(含100mlug/ml氨苄青霉素)：称取胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g,NaCl5g,加双蒸水400

12、ml溶解，用5mol/LNaCl调至PH=7.4，定容至500ml，在103.4kpa下高压灭菌20min大肠杆菌JM103(pUC19),大肠杆菌JM103(pUC19-cTnI)1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37，200 rpm，摇一摇，过夜。 2. 离心10 min，5 000 rpm， 4；弃上淸液。 3. 沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。 4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。 5. 加入1.2 ml Solution II，

13、冰浴5 min。 6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4。 7. 加入1.5 ml异丙醇，-20冰箱内放置15 min。 8. 离心10 min，12 000 rpm，4。 9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。 10. 加入40 ul，3 M NaAc。 11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。 12. 离心10 min，12 000 rpm，4。 13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。 14. 电泳检测提取DNA的质量。1.原理大量碱裂解方法不仅相当快捷可靠，而且可获得相当纯净的粗制DNA，煮沸法的大量制备也简单易行。但得

14、到的DNA比较粗制，高纯度的质粒DNA可通过氯化铯或溴化乙锭平衡离心法或层析法进一步纯化，促使DNA得到。2材料含有氨苄青霉素或其他适当的选择性试剂的LB培养基或丰富培养基带有质粒的大肠杆菌菌株。葡萄糖溶液/Tris/EDTA溶液卵清溶菌酶3mol/l的乙酸钾溶液（PH约5.5）异丙醇70/100乙醇约20ml容量的高速离心管步骤1.往5ml的含选择性试剂（通常是氨苄青霉素）的LB培养基或丰富培养基接种单菌落。于37摄氏度及剧烈震荡培养过夜。2.往2L烧瓶加入500ml含有适当抗生素的LB培养基，然后将1ml过夜培养的大肠杆菌培养物，在与37摄氏度培养至饱和状态注意：以提高产量，应采用表面积较

15、大及带折流板的烧瓶以增大通气度，振摇速度大于400r/min3于4摄氏度，6kg离心10min4用4mlGTE重悬沉淀并转移到一个容积大于等于20ml的高速离心管中5加入1ml新配的含25mg/ml溶菌酶的GTE溶液彻底重悬沉淀，于室温放置10min注意：如果DNA要用层析法纯化，加入5微克/毫升的RNA酶A以降解RNA6加入10ML新配置的NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀至溶液变得均一清亮粘稠10min7就加入7.5ml3mol/L乙酸钾溶液，用吸管轻轻绞拌至粘稠度下降并形成大量沉淀，放于冰上放置10min8于4摄氏度，2万克离心十分钟，将上清轻轻倒入另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物，可用数层纱布过滤。9加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室内放置510分钟，10.室温，15000克离心十分钟。弃上清，加入2ml 70/100乙醇，轻轻洗涤沉淀。11室温，15000克短暂快速离心，吸去乙醇并真空干燥，4摄氏度无限期保存。正常质粒是闭合的双链DNA。在电泳过程中可能使质粒发生开环，或者由开环解开螺旋变成线形。这三种形态电泳时的分离率不同，分离速度不同，分成三带。闭环（超螺旋），开环，线形的螺旋率依次降低。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的