水稻小粒密穗突变体sep1的遗传分析、基因定位与育种利用

1、水稻小粒密穗突变体sep的遗传分析、基因定位与育种利用 王跃星,吴昆,方云霞陈红旗倪深付向东朱旭东,(中国水稻争辩所水稻生物学国家重点试验室,杭州;中国科学院遗传与发育生物学争辩所,北京;共同第一作者;通讯联系人,Email:ricezxdcom)GeneticAnalysis,GeneMappingandBreedingApplicationofSmallGrainandDensePanicleMutantsepinRiceWANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,CHENHongqi,NIShen,FUXiangdong,ZHUXudong,(StateKeyLaborat

2、oryofRiceBiology,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou,China;InstituteofGeneticsandDevelopingBiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,China;Theseauthorscontributedequallytothispaper;Correspondingauthor,Email:ricezxdcom)WANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,etalGeneticanalysis,genemappingandbreedingappl

3、icationofsmallgrainanddensepaniclemutantsepinriceChinJRiceSci,():Abstract:ByCorrayradiation,asmallgrainanddensepaniclemutantsepwasobtainedfromtheindicavarietyShuangkezaoComparedtothewildtypeShuangkezao,itwasamutantwithsmallergrain,shorterspikestalkbutmoregrainnumberperpanicleThehistologicalsliceobse

4、rvationofthemainstemshowedthatthemutanthadmorevascularbundlenumberinonecycleandmorecellnumberperunitareathanthewildtypeGeneticandallelismanalysisresultsshowedthatthesmallgrainanddensepaniclemutantwascontrolledbyarecessivegene,anditwasdifferenttothedensepaniclegeneswhichhadbeenalreadyclonedThenbycons

5、tructingthegeneticsegregatedpopulationandusingtheInDelmarkers,thesmallgrainanddensepaniclegenewasmappedonthecentromericregionofchromosomebetweenmarkerXPandXPInaddition,thebreedingapplicationofthemutantwascarriedoutonCMSlinesandthestabilelinesofhighgenerationshadfinallybeenobtainedKeywords:rice;small

6、grainanddensepanicle;geneticanalysis;genemapping;breedingapplication王跃星,吴昆,方云霞,等水稻小粒密穗突变体sep的遗传分析、基因定位与育种利用中国水稻科学,():摘要:通过Co衰变产生的r射线辐照籼稻品种“双科早”,获得小粒密穗突变体sep,该突变体与野生型双科早相比表现为籽粒变小,穗轴变短,着粒密度增加.主茎切片观看结果显示,突变体维管束数和单位面积细胞数均比野生型多.遗传分析和等位性分析结果表明,该突变体为隐性突变,与已克隆的直立密穗基因不等位.利用InDel分子标记将小粒密穗基因sep定位在第染色体着丝粒四周的两个标

7、记XP与XP之间,物理距离约为Mb.此外,还利用该突变体开展了相应的育种利用争辩,已获得高代稳定的不育系材料.关键词:水稻;小粒密穗;遗传分析;基因定位;育种利用中图分类号:Q;S文献标识码:A文章编号:()禾谷类作物穗的构成主要包括籽粒大小和穗的形态,二者直接打算最终的产量.穗型是水稻育种上一个重要的农艺性状,其主要由一次和二次枝梗的形态、数量和长度打算.粒形和穗型作为水稻抱负株型的重要性状,对于水稻产量增加起到了至关重要的作用,已受到越来越多育种家的重视.国内外已有报道发觉并完成定位克隆的直立密穗基因有DEP(qPE)、DEP(EP)、DEP和EP等.这些基因大多来自粳稻品种或品系.其中,

8、DEP位点是一个把握水稻产量性状的主效QTL,该位点在品种驯化过程中发生突变,产生的dep能导致稻穗变短、直立、着粒密集.dep收稿日期:;修改稿收到日期:.基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(YC);国家方案资助项目(CBA).中国水稻科学(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn欢迎下载是一个来自中花和日本晴的直立密穗突变体.DEP编码一个目前功能未知的植物特有蛋白,主要在幼嫩组织(尤其幼穗)中表达.形态和表达分析表明DEP主要影响穗轴和一、二次枝梗的伸长,但并不减弱穗原基的分化和形成.DEP与小圆粒基因srs和EP为等位基因.dep也来

9、自粳稻,其穗从开花到完熟都保持直立状态,与野生型稻穗在花后就开头下垂的外形明显不同.此外,dep突变体的穗长、粒形以及每穗粒数等性状也发生改变.与野生型相比,dep突变体的维管束更小、茎更粗,这解释了穗直立的表型.EP是使用N甲基N亚硝基脲处理粳稻品种Hwasunchalbyeo,获得一个直立穗突变体hep,遗传分析表明该表型受一个隐型突变基因ep把握.ep突变显著增加了小维管束的数量和穗轴的粗大度,这是产生直立穗表型的缘由.本争辩通过r射线辐照籼稻品种“双科早”获得了份小粒密穗突变体sep(smallgrainanddensepanicle,sep).本争辩对该突变体的表型、生理特征以及主要

10、农艺性状进行了观看,并对sep进行遗传分析和基因定位,为该基因的克隆、功能分析奠定基础.同时,开展了sep在不育系育种中的应用,以期利用该突变等位基因来培育优质高产小粒不育系,起到提高制种效率和节本增效的作用.材料与方法供试材料利用Co衰变产生的r射线辐照籼稻品种“双科早”,获得了大量的形态突变体.其中,sep突变体表现为小粒和密穗性状.于和年将sep突变体与野生型种植于中国水稻争辩所富阳试验基地,成熟期调查株的株高、穗长、牢固率、粒长和粒宽等农艺性状,取平均值.突变体的遗传分析与育种利用突变体基因遗传分析群体为sep与粳稻品种日本晴、美国品种L的F及F群体,配置正、反交.利用sep与光舒(直

11、立穗粳稻)杂交考查其与已经定位基因DEP的等位性关系;利用sep与日本晴的F群体中小粒密穗分别单株对突变体基因开展定位争辩.将sep与华粳籼、稻花香号、中B和中巧B等配组,获得育种利用群体(F,F和回交群体等).对上述各世代材料实行单本移栽,逐株考查单株表型分别状况,在考查直立密穗突变体的同时考查分析直立密穗突变体后代分别的遗传特点.突变体组织切片观看取野生型和突变体的茎秆用FAA固定液固定、保存.石蜡切片制作方法参见文献.突变体的基因定位亲本、F及F遗传群体植株的基因组DNA采用CTAB法提取.通过NCBI(http:/wwwncbinlmnihgov)公布的粳稻日本晴和籼稻的全基因组序列差

12、异查找插入/缺失(InDel)位点,利用PrimerPremiers软件设计InDel分子标记(表,引物由上海英俊生物技术有限公司合成).将提取的DNA用于PCR扩增试验,PCR体系如下:DNAL,正反向引物(mol/L)各L,表本争辩中用于定位的分子标记TableMolecularmarkersformappinginthestudy标记Marker正向引物序列Forwardprimersequence()反向引物序列Reverseprimersequence()物理位置Physicalposition/bpXPCCACCGAAACATAAACATCATCTGGGTTTGTGAATTGAGA

13、ATXPAAAGCCACCTAATAGAATCAAACCATTTGGAGCGGATAGTCXPTACGAAATGGACAAGATAGCACGCTTACTTTCTTCTGGGTGATAXPGCTTCAAAACAATCATCATATCAGTCAAAACGTAGGTACTTCAGXPAAATTGGTTCGTCGCTGGTTAAAACGGAAAACCAAGGGGAAAXPAATAGTTATTCTAGGGGAGGGGCCATTTCATTCCATTTTCATACTXPGCCAAAGAATCCAGCACCCCTTTTCGTTCCCCACCATCCACXPCTCCCTTCCATCGCCACAATCCAAACT

14、CGAAACCGACAAAXPGATAACCGTGCTGTCTCCCCCGCGATACGTTTGTACACCGXPGGATCGAAAGAAACAAAATAGTAGTCCCACGTAAATACAGAAACXPTCCAGGTGATAAGAAAGTGAATGAATGTTGAGTGGTATGCGATGA中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)表双科早及其突变体sep株高和穗相关性状TableComparisonofplantheightandpanicletraitsbetweenShuangkezaoandthemutantsep材料Material株高Plantheight/cm穗

15、长Paniclelength/cm每穗粒数Noofgrainsperpanicle牢固率Seedsettingrate/粒长Grainlength/mm粒宽Grainwidth/mm双科早Shuangkezao±±±±±±sep±±±±±±和两年数据平均.和分别表示野生型与突变体在和水平上差异显著.Valuesaremeansofandandmeandifferencebetweenwildtypeandthemutantatandsignificancelevel,resp

16、ectively表sep与L、日本晴组合F分别的卡方检验TableTestofchisquareonsegregationrateofFpopulationbetweensepandL,Nipponbare组合Combination正常表型株数Normalpanicleplantnumber突变表型株数Mutantplantnumber总株数Totalplantnumber分别比例Segregationratio卡平方检验Chisquaretestsep/L,Psep/日本晴sep/Nipponbare,PdNTPs(mol/L)L,×PCR缓冲液L,Taq酶L,加ddHO补足L.P

17、CR程序如下:下预变性min;下s,下s,下s,个循环.PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳,电泳结束后在凝胶成像仪拍照并读胶.统计分析接受MicrosoftExcel软件进行数据统计,用SAS软件进行方差分析.结果与分析突变体的表型鉴定小粒密穗突变体sep与野生型双科早相比,表现为籽粒变小,穗型变短,着粒密度增加,植株变矮(图).此外,生育期、分蘖数、牢固率等性状无明显差异,其小粒密穗性状能稳定遗传.突变体sep与野生型双科早株高及穗部考种数据见表.突变体的显微结构从野生型双科早和小粒密穗突变体sep的成熟植株主茎进行切片(图)可以观看到,不论是主茎横切面还是纵切面,野生型植株主茎细胞均比突变体

18、略大,突变体细胞排列更紧密,细胞数量更多.突变体主茎横切面维管束数量(图C)显著多于野生型;纵切面单位面积细胞数量(图F)也显著多于野生型.这一结果说明突变体植株整体细胞数量增多,排列更紧密,且细胞横向进展明显,从而造成图双科早与突变体sep的表型比较FigComparisonofplants,paniclesandgrainsofShuangkezao(SKZ)andsep了株高降低,同时也构成了突变体每穗粒数显著增加的组织结构基础.突变体的遗传分析及基因定位在sep与L、日本晴等配组后,杂交F均表现为正常表型,F穗型发生分别,遗传比例符合正常表型突变表型(表),表明sep小粒密穗突变表型受

19、单隐性核基因把握.王跃星等:水稻小粒密穗突变体sep的遗传分析、基因定位与育种利用 A双科早横切;Bsep横切;C横切面维管束数量;D双科早纵切;Esep纵切;F纵切面虚线框面积中细胞数.A,CrosssectionofShuangkezao;B,Crosssectionofsep;C,Statisticcomparisonofvascularbundlenumberinonecycle;D,LongitudinalsectionofShuangkezao;E,Longitudinalsectionofsep;F,Cellnumberinthedottedbox图双科早和突变体sep茎的显微结

20、构比较FigMicroscopicstructurecomparisonbetweenShuangkezaoandsep图sep基因在第染色体上位置FigLocationoftheseponChromosome将突变体sep分别与携dep基因的光舒杂交,进行等位性检测,结果表明sep基因与dep不等位,为新的小粒密穗基因.利用本试验室均匀分布于条染色体的对公共引物对sep/日本晴的F分别群体进行连锁分析,初步确定目标基因位于第染色体着丝粒四周,介于InDel标记XP与标记XP之间的约Mb区间内,在该区域还未有相关基因的报道.进一步在连锁标记四周开发了对存在多态的InDel标记(表),利用这些标

21、记以株分别单株为材料对突变体基因进行进一步的定位,最终将sep定位于着丝粒四周的InDel标记XP与标记XP之间约Mb的区间内(图).突变体sep的育种利用对突变体sep与华粳籼、稻花香号、中B的分别世代重点选择小粒密穗、异交习性好、米质优异的单株,用相应的轮回亲本进行连续回交,在中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)HJX华粳籼;DHX稻花香号.HJX,Huajingxian;DHX,Daohuaxiang图NILsep(sep/华粳籼后代株系)、NILsep(sep/稻花香号后代株系)与亲本籽粒、株高及穗部性状比较FigComparisonofgrain,planthei

22、ghtandpanicletraitsbetweenHJXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/HJX),DHXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/DHX)选择突变性状同时,兼顾选择系内株间较整齐、花时较早、柱头外露的单株,年分别从sep/华粳籼组合和sep/稻花香号组合获得了稳定不育系NILsep和NILsep.NILsep和NILsep与各自轮回亲本籽粒相比(图),它们的穗长变短,籽粒变小,植株变矮,但着粒密度增加.争辩目前在我国长江中下游地区和东北辽宁省、吉林省的部分稻区种植的直立和半直立穗型的高产粳稻品种都含有D

23、EP突变基因,表明DEP已在我国水稻增产中发挥了关键作用.大量粳型密穗品种的推广种植实践表明,密穗型品种植株细胞纵向缩短、横向变长,细胞数目也同时增多,表现为株高降低,茎杆更粗大,穗型直立,着粒密度增加,最终也能达到稳产高产的抱负状态.从群体光能利用效率抗倒伏力量来看,密穗型品种也具有肯定的形态优势.争辩者利用r射线辐照籼稻品种双科早时获得了大量的形态突变体,其中共有份密穗型突变体,分别编号为SKZ、SKZ、SKZ(sep)、SKZ和SKZ.杂交等位性分析和基因定位结果表明,突变体SKZ、SKZ、SKZ密穗性状把握基因与已克隆基因DEP等位,基因定位结果均位于号染色体相同位置;突变体SKZ密穗

24、性状把握基因和DEP、DEP、DEP都不等位(该突变体基因的定位工作正在进行中);突变体SKZ(sep)密穗性状把握基因与DEP、DEP、DEP均不等位,且sep和SKZ密穗性状把握基因间不等位.与其他份突变体相比,sep不但同时表现出典型的小粒密穗,且牢固率等性状均未消灭明显下降(表),因此首先针对该材料开展遗传分析,基因定位和育种利用的工作.在杂交稻不育系选育中,为求得到更高的杂交水稻产量潜力,提高千粒重是现行接受的手段之一,但这也同时导致了稻农用种量的增加而投入更多用于购种的成本,.以往推广的不育系中大多为大粒品种,如龙特甫A、A和内香A等,只有极少数小粒不育系如博白A,而且也仅局限在两

25、广(广东和广西)地区推广较多.另一方面,杂交水稻种子生产成本逐年上升,直接导致了杂交种的价格的快速上涨.年杂交水稻种子市场价格总体比年上涨了;年杂交水稻种王跃星等:水稻小粒密穗突变体sep的遗传分析、基因定位与育种利用 子价格比年上涨了,其中部分市场主导品种价格上涨幅度远大于全国平均涨幅,甚至有少数品种价格涨幅超过;年全国三系杂交稻均价元/kg,同比上涨,两系杂交中稻均价元/kg,同比上涨.因此,如何提高制种效率,降低制种成本,达到节本增效的同时,减轻农夫购种负担,是一个急需解决的问题.通过小粒密穗突变体sep的发掘和利用,可以将隐性的小粒密穗基因导入不育系,使籽粒变小同时每穗粒数增加,这样在

26、相同制种面积下,可产出更多粒数的杂交稻种子,而在杂交稻F代,该隐性性状又不会消灭,从而不转变杂交稻生产出的谷粒大小,保持高产农艺性状,最终削减制种面积,提高土地利用效率,降低种子公司制种成本,削减稻农购种的成本,增加稻农的收益.在杂交水稻种子快速上涨的背景下,这不失为一个有效的策略.当然小粒不育系种子在发芽率,发芽势上,以及叶期前幼苗养分供应方面,与大粒品种间是否存在差异,如何在育种实践和生产中真正开展运用还有待进一步争辩和探讨.参考文献:HuangXZ,QianQ,LiuZB,etalNaturalvariationattheDEPlocusenhancesgrainyieldinriceN

27、atGenet,():YanCJ,ZhouH,YanS,etalIdentificationandcharacterizationofamajorQTLresponsibleforerectpanicletraitinjaponicarice(OryzasativaL)TheorApplGenet,():ZhouY,ZhuJY,LiZY,etalDeletioninaquantitativetraitgeneqPEassociatedwithpanicleerectnessimprovesplantarchitectureduringricedomesticationGenetics,():FumioTS,YasushiK,HiroshiK,etalAlossoffunctionmutationofricedensepaniclecausessemidwarfnessandslightlyincreasednumberofspikeletsBreedingSci,():LiF,LiuWB,TangJY,etalRicedenseanderectpanicleisessentialfordetermi