细胞培养基本技术实践、细胞培养传代计数与冻存

1、细胞培养 Cell culture模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 实验室常用的细胞培养实验室常用的细胞培养 常用的名称常用的名称组织来源组织来源 Hep-2Hep-2HeLaHeLaA549A549VeroVero HEKHEKCHOCHO 人喉癌人喉癌人子宫颈癌人子宫颈癌人肺癌人肺癌非洲绿猴肾非洲绿猴肾人胚肾人胚肾中国地鼠卵巢细胞中国地鼠卵巢细胞 代表性的细胞命名法代表性的细胞命名法 细胞名细胞名称称命名意义命名意义 HeLa为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary

2、）宫-743宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3美国国立卫生研究所（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等，其中 ATCC不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系，其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室

3、免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费）。 每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）细胞培养方式 n群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层n克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 群体培养（左）和克隆培养（右） 完全培养基的组成n基础培养基 80一95n血清 5一20n碳酸氢钠 2.0 g/Ln青

4、、链霉素 各100单位毫升培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml，过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 细胞培养基本方法（无菌原则）n无菌工作台用75%酒精擦拭干净，紫外线照射30分钟以上。n清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。n操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，严格注意无菌操作。细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。n悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传

5、代。n半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。n贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法n吸光培养瓶中的培养液nPBS洗去残留培养液n加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）n静置2-10 min（显微镜下动态监测）。n加入培养液，终止胰酶消化作用。n用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。n吸取1/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内。n加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。n将后者放入培养箱中培养。细胞冻存和复苏n细胞低温冷冻贮

6、存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 n如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。n复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序n标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器n简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱

7、布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法n预先配制冻存液： 含20%血清培养基n 10% DMSO n取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)

8、n加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞复苏方法n从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。n5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。n低速离心10分钟。n去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞计数n血细胞计数板n计数仪 Counter 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。 培养细胞活力测定台盼蓝法，trypan blue， 利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力细胞计数 取10ul 细胞悬液，稀释于990ul PBS，取10ul自血球计数盘chamber 上方凹槽加入(已盖上盖玻片