金属硫蛋白对奶牛抗应激能力的影响#

1、中国科技论文在线金属硫蛋白对奶牛抗应激能力的影响基金项目：国家自然科学基金项目（31072053；30671516）和湖南省博士生科技创新基金项目（CX2010B284） 杨夏1，李丽立2，张彬1作者简介：杨夏（1988-），女，动物科学专业应届毕业生通信联系人：张彬（1955-），男，博士，教授，博导，主要研究方向：动物营养生理. E-mail: zhb8236College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128;Institute of Subtropical Agric

2、ultural Ecology,The Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125;College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128;中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125;湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128410128;410125;41012815874275682139758907290731-84618088;0731-8

3、4618088长沙市湖南农业大学动物科学技术学院;长沙市芙蓉区中国科学院亚热带农业生态研究所;长沙市湖南农业大学动物科学技术学院274188254QQ.com;isi;zhb8236杨夏（1988-），女，动物科学专业应届毕业生;李丽立（1956），女，研究员，主要研究方向：动物营养学;张彬（1955-），男，博士，教授，博导，主要研究方向：动物营养生理杨夏;李丽立;张彬YANG Xia;LI Lili;ZHANG Bin张彬国家自然科学基金项目（31072053；30671516）和湖南省博士生科技创新基金项目（CX2010B284）1.5|1|杨夏|YA

4、NG Xia|湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128|College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128|杨夏（1988-），女，动物科学专业应届毕业生|长沙市湖南农业大学动物科学技术学院|410128|274188254QQ.com15874275682<CR>|2|李丽立|LI Lili|中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125|Institute of Subtropical Agricultural Ec

5、ology,The Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125|李丽立（1956），女，研究员，主要研究方向：动物营养学|长沙市芙蓉区中国科学院亚热带农业生态研究所|410125|isilt;CR>*|3|张彬|ZHANG Bin|湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128|College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128|张彬（1955-），男，博士，教授，博导，主要研究方向：动物营养生理

6、|长沙市湖南农业大学动物科学技术学院|410128|zhb823613975890729金属硫蛋白对奶牛抗应激能力的影响|Effects of metallothionein on anti-stress ability in dairy cattle|国家自然科学基金项目（31072053；30671516）和湖南省博士生科技创新基金项目（CX2010B284）- 6 -（1. 湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2. 中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125）摘要：为探讨外源性金属硫蛋白(MT)对奶牛抗应激能力的影响，选取24头中国荷斯

7、坦奶牛经产泌乳母牛，随机等分为A、B、C、D 4组，分别每头静脉注射经生理盐水溶解的Zn-MT 0（对照），5.0，10.0和15.0 mg，测定了各组奶牛的GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶活性、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。结果表明：B组、C组和D组奶牛的GSH-Px、SOD、CAT和T-AOC均显著（P0.05或P0.01）高于对照组；而MDA含量均显著（P0.05）低于对照组。说明MT不失为一种能够有效调控奶牛抗应激能力的生理活性物质。关键词：金属硫蛋白；抗应激；GSH-Px；CAT；T-AOC；MDA；奶牛中图分类号：S813.4Effects of meta

8、llothionein on anti-stress ability in dairy cattleYANG Xia1, LI Lili2, ZHANG Bin1(1. College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128;2. Institute of Subtropical Agricultural Ecology,The Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125)Abstract: In order to approach

9、the effects of exogenous metallothionein(MT) on anti-stress ability in dairy cattle, 24 lactating cows from Chinese Holstein wrer used in this experiment. They were randomly allocated to Group A,groupB, Group C and Group D,and MT was supplemented at 0 mg.capita-1,5.0 mg.capita-1,10.0 mg.capita-1 and

10、 15.0mg.capita-1 respectively by intravenous injection.The results showed that the activities of blood GSH-Px, Erythrocyte SOD and serum CAT and the serum levels of the cows in group B,Group C and Group D were higher（P0.05 or P0.01）than those in Group A,while the serum MDA content were lower（P0.05）t

11、han those in Group A. The experimental results suggested that exogenous MT should be an effective anti-stress substance and physiologic accommodation composition for dairy cattle.Key words: metallothionein；anti-stress；GSH-Px；CAT；T-AOC；MDA；dairy cattle0 引言金属硫蛋白(metallothionein，MT)是动物体内广泛存在的重要的生理活性物质，

12、在清除体内自由基、增强机体的免疫力，提高机体抗氧化应激能力等方面具有广泛而重要的生理学和生物学功能1-3，因而在促进动物健康养殖、提高畜产品质量、保证人类健康和食品安全等方面均具有重大意义和广阔应用前景。但国内外对MT的研究对象至今仍主要局限于实验动物和人类，而以畜禽尤其是奶牛为研究对象的报道不多4。鉴于由奶牛生物学特性决定的应激敏感性以及奶和奶制品抗氧化的重要性，本论文拟以中国荷斯坦奶牛为实验对象，研究外源性MT对夏季热应激条件下奶牛的常规生理指标及与应激相关的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶(CAT)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和丙

13、二醛(MDA)含量的影响，为MT的理论研究及其在生产优质安全奶产品中的应用提供科学依据。1材料与方法1.1材料及其来源MT系用锌诱导法5制备、分离和纯化的奶牛肝脏Zn-MT，并用间接竞争型ELISA法6定量。GSH-Px试剂盒、SOD试剂盒、CAT试剂盒、T-AOC试剂盒和MDA试剂盒均系南京建成生物工程研究所产品。1.2试验动物的选择、分组与试验设计 2009年7月-8月从长沙市某奶牛场选取年龄、体重、胎次、产犊时间、日泌乳量及以往泌乳期的产奶成绩相近的中国荷斯坦奶牛健康经产泌乳牛24头，随机分为A、B、C、D 4组，每组6头。其中A组为对照组，B、C、D组为试验组，分别在正式试验开始的当天

14、（1d）每头静脉注射经生理盐水溶解的Zn-MT 5.0 mg、10.0 mg和15.0mg。预试期7d，正试期45d(1d-45d)。1.3饲养条件与管理方式各组奶牛饲喂相同日粮，日粮组成（kg/capita.d）：混合精料5.6、象草20.0、稻草10.0；合计35.6。每头日摄入产奶净能92.26MJ、粗蛋白1646.64 g、钙69.76 g、磷43.44g。供试奶牛饲养在同一幢双列式牛舍。专人饲养管理。各组奶牛的饲养管理方式一致。1.4测定项目与方法在正试期的第1d（注射MT前）、第15d、第30d和第45d分别从供试奶牛静脉采血。GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC和MDA的测定

15、采用南京建成生物工程研究所提供的相应各类试剂盒并按试剂盒说明书操作。1.5 数据处理与统计分析数据均以平均数±标准差表示。采用SAS6.12统计软件进行方差分析(GLM过程)，用Duncan统计方法进行多重比较以检验组间差异显著性。2结果与分析2.1 MT对奶牛血液GSH-PX活性的影响补给外源性MT对奶牛血液GSH-PX活性变化的影响见表1。在正试期开始时（第1d），奶牛血液GSH-PX活性在各组间并没有显著差异（P0.05）。正试期第15d测得3个试验组（B组、C组和D组）奶牛血液的GSH-PX活性分别显著（P0.05）或极显著（P0.01）地高于对照组（A组），而D组又显著（P

16、0.05）地高于B组。正试期第31d测得3个试验组的GSH-PX活性也分别显著（P0.05）或极显著（P0.01）地高于对照组，并且C组和D组均显著（P0.05）地高于B组。在正试期第45d测得的结果是: C组和D组奶牛血液的GSH-PX活性均显著（P0.05）地高于A组和B组。从正试期不同日龄所测奶牛血液的GSH-PX活性看，A组不同日龄间GSH-PX活性没有大的变化（P0.05），3个试验组在补给外源性MT后，奶牛血液的GSH-PX活性均有显著提高，至31d达最高值，45d有所下降。其中B组第15d和第30d的GSH-PX活性显著（P0.05）高于第1d和第45d。C组和D组第15d、第3

17、0d和第45d的GSH-PX活性均极显著（P0.05或P0.01）地高于第1d。就15-45d平均值比较而言，B组和C组均显著（P0.05）高于A组；而D组则极显著（P0.01）地高于A组并显著（P0.05）高于B组。表1 各组奶牛血液GSH-PX活性 Table 1 Blood GSH-Px activityt of the cows in different groups (U.L-1)A组 Group A B组 GroupBC组 Group C D组 Group D1d 257.32±24.38aA 256.27±25.73aA 255.89±26.24aA

18、 261.12±26.44aA 15d 263.24±27.10aA 297.73±30.05bB 313.04±29.78bcC 353.92±34.07cC30d 261.56±23.88aA 298.96±34.97bB 341.00±27.87cC 358.19±36.84cC45d 256.06±25.26aA 286.73±28.16aB 319.44±31.04bC 323.08±28.73bC15-45d平均值 260.29±25.88aA

19、 294.47±29.24bB 324.49±27.16bcC 345.06±30.84cC The mean during 15-45d注：同行肩标用小写字母表示，同列肩标用大写字母表示。同行（或同列）肩标相同字母示差异不显著（p0.05），相邻字母示差异显著（P0.05），不相邻字母示差异极显著（P0.01）。下同。There are significant differences between figures in the same row with different lower-case letters such as a,b and b,c(P<

20、;0.05) or a,c(P<0.01),.and there are significant differences between figures in the same column with different capital-case letters such as A,B and B,C(P<0.05) orA,C(P<0.01).The same below.2.2 MT对奶牛红细胞SOD活性的影响从表2可以看出：在正试期第15d测得C组和D组奶牛红细胞SOD活性均显著（P0.05）高于A组，而B组的SOD活性又比A组高出11.31（P0.05）。在正试期第3

21、0d和第45d，B组、C组和D组奶牛红细胞SOD活性均显著（P0.05）高于A组。补给外源性MT后，B组、C组和D组奶牛红细胞SOD活性均有明显提高，其中B组第30d和第45d的SOD活性显著（P0.05）高于第1d；C组和D组第15d、第30d和第45d的SOD活性均显著（P0.05）或极显著（P0.01）地高于第1d。从15-45d平均值看，B组、C组和D组奶牛红细胞SOD活性也均显著（P0.05）地高于B组。表2 各组奶牛红细胞SOD活性 Table 2 Erythrocyte SOD activityt of the cows in different groups（U.mL-1)A组

22、 Group A B组 GroupBC组 Group C D组 Group D1d 2249.24±218.14aA 2302.28±226.66aA 2230.26±222.76aA 2259.24±223.97aA15d 2270.27±223.48aA 2526.94±219.63abAB 2649.79±258.47bBC 2656.47±274.11bBC30d 2261.30±219.73aA 2602.26±245.47bB 2746.44±264.73bC 2701.3

23、1±267.46bC45d 2273.63±234.74aA 2601.61±252.46bB 2734.92±293.24bC 2693.47±267.32bBC15-45d平均值 2268.40±217.79aA 2576.94±240.27bB 2710.38±277.01bC 2683.75±268.14bBC The mean during 15-45d2.3 MT对奶牛血清CAT活性的影响如表3所示：试验开始后，3个试验组奶牛血清CAT活性也均较对照组有较大幅度的提高。在正试期第15d和第30

24、d，B组、C组和D组奶牛血清的CAT活性分别显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)地高于对照组。D组在正试期第45d的CAT活性也显著(P<0.05)高于对照组；而B组和C组的CAT活性也高于对照组并低于D组，但均无显著差异(P>0.05)。就正式试验开始后3次测定的结果平均值而言，D组CAT活性分别显著高于对照组(P<0.01)和B组(P<0.05)，而C组也显著高于对照组(P<0.05)。就组内不同阶段相比较，B组仅第15d时的CAT活性较正式试验开始时有明显提高(P<0.05)；而C组和D组第15d、30d和45d的CAT活性均比正式

25、试验开始时有明显提高(P<0.05或P<0.01)。 表3 各组奶牛血液CAT活性 Table 3 Serum CAT of the cows in different groups (U.L-1)采样时间Time of samplingA组Group AB组Group BC组Group CD组Group D1d 2.63±0.27 aA 2.57±0.30 aA 2.66±0.26 aA 2.69±0.32 aA15d 2.55±0.30 aA 2.89±0.27bcB 3.29±0.33bcBC 3.54&#

26、177;0.36cC30d 2.56±0.29 aA 2.71±0.28aA 3.08±0.32cC 3.30±0.29cBC45d 2.52±0.26 aA 2.65±0.24abAB 2.81±0.27abBC 2.97±0.30 bBC15-45d平均值 2.54±0.26a 2.75±0.27ab 3.06±0.29bc 3.27±0.31cThe mean during 15-45d 2.4 MT对奶牛血清T-AOC的影响从表4可以看出，补给外源性MT后的第15d和

27、第30d，C组和D组奶牛血清T-AOC分别极显著(P<0.01)高于对照组，而B组也显著(P<0.05)高于对照组。D组在第45d时的T-AOC极显著(P<0.01)高于对照组和B组，并且显著(P<0.05)高于C组；B组和C组又分别显著(P<0.05)高于对照组。3个试验组在后3个阶段测得的T-AOC均较正式试验开始时有显著(P<0.05，B组)或极显著(P<0.01，C组和D组)提高，仅对照组的T-AOC在各阶段的变化不明显(P>0.05)。D组在正式试验开始后3次测定的奶牛血清T-AOC平均值分别显著(P<0.05)地高于B组并且极显

28、著(P<0.01)地高于对照组；B组和C组也显著(P<0.05)地高于对照组。表4 各组奶牛血清T-AOC Table 4 Serum T-AOC of the cows in different groups (U.L-1)采样时间Time of samplingA组Group AB组Group BC组Group CD组Group D1d 7.11±0.70 aA 7.28±0.72 aA 7.27±0.71 aA 7.36±0.69 aA15d 7.10±0.68 aA 8.28±0.84bcB 8.89±0

29、.88cC 9.17±0.97cC30d 7.17±0.71aA 7.86±0.77bcB 8.74±0.83cC 9.07±0.86cBC 45d 7.15±0.74aA 7.80±0.78bB 8.55±0.84bcB 8.84±0.86dBC15-45d平均值 7.14±0.70a 7.98±0.76b 8.73±0.83bc 9.03±0.87cThe mean during 15-45d2.5 MT对奶牛血清MDA含量的影响由表5可知，与前已述及的MT对奶

30、牛GSH-PX、SOD、CAT等抗氧化酶活性和T-AOC的影响形成鲜明对照的是：补给外源性MT后，3个试验组奶牛血清MDA含量均较对照组有不同程度的降低。其中B组第45d、C组第30d和第45d、D组第15d、第30d和第45d的MDA含量显著（P0.05）低于A组。3个试验组在正式试验开始后3次测定的奶牛血清MDA含量平均值均显著(P<0.05)高于对照组，而在3个试验组之间没有明显差异（P0.05）。各组内不同时间所测MDA含量的变化趋势大体是：随着MT处理后时间的延长，奶牛血清MDA含量递减。其中B组第45d、C组第30d和第45d、D组第15d、第30d和第45d的MDA含量显著

31、（P0.05）低于用MT处理之前的MDA含量。表5 各组奶牛血清MDA含量 Table 5 Serum MDA content of the cows in different groups (mmoL.L-1)A组 Group A B组 GroupB C组 Group C D组 Group D1d 4.37±0.42aA 4.32±0.44aA 4.49±0.46aA 4.38±0.39aA15d 4.35±0.42aA 4.09±0.42aA 4.00±0.41aAB 3.89±0.35bB30d 4.39&#

32、177;0.41aA 3.95±0.40abAB 3.81±0.36bB 3.72±0.36bB45d 4.41±0.44aA 3.77±0.41bB 3.70±0.39bB 3.62±0.37bB15-45d平均值 4.38±0.39a 3.93±0.41b 3.84±0.37b 3.74±0.38bThe mean during 15-45d3 讨论集约化生产以及对畜禽主要经济性状施加强大选择压是现代畜牧业的基本特征之一。集约化生产环境和高强度的生产状态，时时刻刻对畜禽产生着重大的

33、影响，尤其是处于高强度生产状态和具有高敏感性体质的奶牛，应激更为频繁和剧烈。一般认为：应激的始作俑者是自由基(freera dical)，许多生物分子都可成为其攻击对象，受其攻击而产生的脂质过氧化的产物(如MDA)不但攻击生物膜上的蛋白质和脂类，而且还攻击细胞内其它的巯基酶和巯基蛋白，甚至DNA、RNA，从而引起过氧化损伤，造成细胞结构和功能的损害，使机体产生氧化应激，免疫力和生产力下降、出现病变、甚至死亡7。体内有自由基产生，也存在自由基清除系统。正常情况下，机体存在一个完整的包含酶系和非酶系的抗氧化系统，抗氧化酶包括GSH-PX、SOD、CAT等，非酶系抗氧化剂有VE、一胡罗卜素、还原性谷

34、胱甘肽等，它们协同作用，使体内过多的自由基转变为无害的水，使自由基的产生与清除处于动态平衡之中，防止生物分子产生损伤。起到抗氧化的作用8。因此，MDA含量常常反映了机体脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。而GSH-PX、SOD、CAT等抗应激酶活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。 MT这种富含半胱氨酸巯基的功能性结合蛋白，是一种强的自由基清除剂，能有效防止脂质过氧化和DNA损伤，起到应激保护作用9。前人研究表明，用酵母类金属硫蛋白饲喂小鼠，适宜剂量的MT可降低肝中过氧化脂质(LPO)含量，能提高体内SOD等氧化酶的活性10。另有报道，以不同剂量的Zn-MT灌喂昆明小鼠，MT具有提高小鼠肝中SOD、GSH-PX活力（P<0.05，P<0.01）和降低肝中MDA含量（P<0.05）以及增强免疫的作用11。本研究结果表明，注射外源Zn-MT后，在一定的时间和浓度下，可显著提高奶牛血液GSH-PX、C