酵母菌发酵玉米皮制备菌体蛋白饲料#

1、中国科技论文在线酵母菌发酵玉米皮制备菌体蛋白饲料基金项目：国家自然科学基金项目(No. 61361016)； 教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(No. 2013151412000)；内蒙古自治区草原英才工程项目；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划项目 王雅波1，刘占英1，段申2，胡建华1，李永丽1，石雅丽1作者简介：王雅波(1993-)，女，研究生，生物质资源化通信联系人：刘占英,女，教授. E-mail: liuzy19791.51.51.51.5 Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongo

2、lia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongolia agricultural university, college of life science;Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051内蒙古工业大学化工学院;内蒙古工业大学化工学院;内蒙古农业大学

3、生命科学学院;内蒙古工业大学化工学院;内蒙古工业大学化工学院;内蒙古工业大学化工学院010051;0100511594711665915947116659;内蒙古工业大学化工学院;内蒙古工业大学化工学院;798852154;liuzy1979;85993750;hhh.a2003;sorry1115;shiyali2006王雅波(1993-)，女，研究生，生物质资源化;刘占英,女，教授;王雅波;刘占英;段申;胡建华;李永丽;石雅丽WANG Yabo;LIU Zhanying;DUAN Shen;HU Jianhua;LI Yongli;SHI

4、 Yali刘占英国家自然科学基金项目(No. 61361016)； 教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(No. 2013151412000)；内蒙古自治区草原英才工程项目；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划项目1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51*|*学位论文*|*史建国.基于SPCE061A型单片机的食品螺杆膨化机温度的检测与控制D.济南：山东大学, 2007. 2*|*期刊*|*丁声俊. 发展玉米深加工业应掌握适度J. 粮食与食品工业, 2011, 18(4):1-4. 3*|*期刊*|*WuYV, Norton RA. Enriehmen

5、t of Protein,starch,fat,and sterol ferulates from corn fiber by finegrinding and air elassifieation J. Industrial Crops and Produets, 2001, 14(2):135-13. 4*|*期刊*|*Mendona S, Grossmann M V E, Verh R. Corn Bran as a Fibre Source in Expanded Snacks J. LWT - Food Science and Technology, 2000, 33(1):2-8.

6、5*|*期刊*|*Holguin-Acuna A. L. , Carvajal-Millan E. , Santana-Rodriguez V. , et al. Maize bran/oat flour extruded breakfast cereal: A novel source of complex polysaccharides and an antioxidant J. Food Chemistry, 2008, 111(3):654-657. 6*|*期刊*|*代养勇, 董海洲, 王志刚,等. 我国玉米深加工产业现状及发展趋势J. 中国食物与营养, 2011, 17(4):37

7、-39.7*|*期刊*|*孙付保,陈晓旭,陈晓萍等.混合菌株固态发酵玉米皮生产饲料蛋白J. 食品与生物技术学报, 2010, 29(6):916-920.8*|*期刊*|*张博润,刘玉方,何秀萍等.发酵饲料蛋白的培养条件及产物分析J.微生物学报,1997,37(4):281-284.9*|*学位论文*|*陈晓萍. 副产物玉米皮固态发酵高值化的研究D. 无锡：江南大学, 2009.10*|*期刊*|*王良仓.玉米皮的综合利用J.中文信息,2013.06.11*|*期刊*|*沈兆兵,刘晓洁,刘莉等.拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052发酵玉米皮生产丁醇J.

8、 2014, (5):361-367.12*|*期刊*|*冯继华, 曾静芬, 陈茂椿, 侯正高.应用VanSoest法和常规法测定纤维素及木质素的比较J.西南民族学院学报(自然科学版). 1994,(1).13*|*其他文献*|*GB/T 20805-2006 饲料中酸性洗涤木质素（ADL）的测定.14*|*期刊*|*GB/T 6432-94 饲料中粗蛋白的测定方法.15*|*期刊*|*郭冬生,彭小兰.蒽酮比色法和酶水解法两种淀粉测定方法的比较研究J.湖南文理学院学报(自然科学版).2007,(3).16*|*其他文献*|*GB/T 6433-2006/ISO6492:1999 饲料中粗脂肪的

9、测定.17*|*期刊*|*李秀花.酸水解法测定食品中脂肪含量与索氏抽提法的比较J.山西医科大学学报.1999, (4). 18*|*期刊*|*张国华, 考桂兰, 李宝栋,等. 酵母菌紫外诱变时洗涤液与离心转速的选择J. 畜牧与饲料科学, 2008, 29(3):40-42. 19*|*专著*|*沈萍，陈向东.微生物学实验M.4版.北京：高等教育出版社,2007. 20*|*期刊*|*Palmarola-Adrados B, Borska PC, Galbe M, Zacch G. Ethanol production from non-starch carbohydrates of wheat

10、 bran J. Bioresource Technology, 2005, 96(7):843-50.21*|*期刊*|*Javed M M, Zahoor S, Shafaat S, et al. Wheat bran as a brown gold: Nutritious value and its biotechnological applications J. African Journal of Microbiology Research, 2012, 6(4):724-733. 22*|*期刊*|*乔君毅, 亢晋, 张福元,等.黑曲霉发酵玉米秸秆产纤维素酶的研究J. 饲料研究,

11、2008(12):63-66.|1|王雅波|WANG Yabo|内蒙古工业大学化工学院| Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|王雅波(1993-)，女，研究生，生物质资源化|内蒙古工业大学化工学院|010051|79885215418347151305*|2|刘占英|LIU Zhanying|内蒙古工业大学化工学院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|刘占英,女，教授|内蒙古工业大学化工学院|010051|liuzy1979|

1215947116659|3|段申|DUAN Shen|内蒙古农业大学 生命科学学院|Inner Mongolia agricultural university, college of life science|85993750|4|胡建华|HU Jianhua|内蒙古工业大学化工学院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|hhh.a2003|5|李永丽|LI Yongli|内蒙古工业大学化工学院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 01005

13、1|sorry1115|6|石雅丽|SHI Yali|内蒙古工业大学化工学院|Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051|shiyali2006|酵母菌发酵玉米皮制备菌体蛋白饲料|Preparation of protein feed from corn bran by yeast fermentation|国家自然科学基金项目(No. 61361016)； 教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(No. 2013151412000)；内蒙古自治区草原英才工程项目；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划项目- 7 -（1. 内

14、蒙古工业大学化工学院；2. 内蒙古农业大学 生命科学学院）摘要：玉米皮作为玉米加工过程中的主要副产品，营养价值丰富，可作为既缓和资源短缺又降低工业成本的优质饲料来源，但目前各玉米淀粉厂对其的综合利用不够完全，导致部分资源浪费。本文旨在采用饲料国标测定法对玉米皮中纤维素类等有效成分进行测定，并以玉米皮为原材料，采用毕赤酵母菌2.3250发酵的方法降解玉米皮中的纤维素类物质使其充分转化为高附加值的饲料蛋白。结果表明，玉米皮中的纤维素和半纤维素含量分别为16.40% 和47.68%，蛋白质含量为11.49%、淀粉含量为15.50%、脂肪含量为2.73% 以及木质素含量为5.41%。另外，利用毕赤酵母

15、菌转化玉米皮时，在无蛋白胨添加的情况下，25恒温培养48h，毕赤酵母菌浓度最高，为2.31107个/mL。经过微生物发酵，玉米皮中纤维素含量由 16.40%降到 6.22%，半纤维素含量由47.68%降到33.45%。该研究不仅对玉米皮的重要组分进行了系统分析，并且还为利用酵母菌发酵玉米皮生产高附加值的菌体蛋白饲料等后续研究奠定基础。关键词：玉米皮；酵母；菌体蛋白饲料中图分类号：Q815Preparation of protein feed from corn bran by yeast fermentationWANG Yabo1, LIU Zhanying1, DUAN Shen2, HU

16、 Jianhua1, LI Yongli1, SHI Yali1(1. Inner Mongolia University of Technologe,Hohhot 010051;2. Inner Mongolia agricultural university, college of life science)Abstract: Corn bran of the main by-product of the corn, which riches in nutritional value. As a high quality source of feed, corn bran is not o

17、nly to ease the shortage of feed resource, but also reduce the cost of feed industry. However the comprehensive utilization of the corn starch plant is completely inadequate, resulting in part of the waste of resources. This paper aims to determinate effective components of corn husk cellulose by th

18、e feed national standard method, and taking maize peel as raw material, degrade corn husk cellulose material to make it fully into high value-added feed protein using Pichia pastoris 2.3250 fermentation method. The experimental results showed that the contents of cellulose and hemicellulose in corn

19、bran were 16.40% and 47.68% respectively, and the protein content was 11.49%, and the starch content was 15.50%, and then the fat content was 2.73% and the lignin content was 5.41%.When using the methylotrophic yeast Pichia pastoris transformed corn skin components, in the absence of peptone added,

20、culture temperature was set to 25, and the speed was set to150 r/min, culturing for 48h, microbial feed protein concentration is the highest, and the yeast cell number is 2.31107ml-1 and the content of cellulose decreased from 16.40% to 6.22%, and the hemicellulose content decreased from 47.68% to 3

21、3.45%. The study is not only an important for group of corn bran which carried by the system analysis, but also laid the foundation for the further research on the production of high added value of bacterial protein feed by using yeast fermentation. Key words: Corn bran, yeast, bacterial protein fee

22、d 0 引言玉米是我国的主要粮食作物之一，我国现今拥有几百家玉米淀粉加工厂。玉米皮是玉米淀粉加工的主要副产物之一，大约占玉米总质量的12%1，但玉米皮并未得到充分利用，产品附加值极低，导致主产品成本增高，利润率下降，造成市场竞争力变弱及社会效益降低的局面，如若可以更深层次的开发利用玉米的深加工副产物玉米皮2，就能极大的带动玉米加工企业的经济效益。近年来国内外逐渐增多了玉米皮的研究，Wu和Norton3，在玉米皮膳食纤维中提取得到了裕醇阿魏酸酷；Mendonca4 等人发现玉米皮能显著的降低点心的纵向胀率；Holguin等人用玉米皮取代燕麦制作早餐谷物5。与此同时，因饲料工业存在饲料蛋白供不应求

23、的现象6，仅依靠生产以往使用的蛋白类饲料根本无法满足饲料生产迅速发展的需求，故研究者们将研究热点放到发展微生物饲料蛋白领域6，玉米皮即是该产业的首选原材料。孙付保等人7利用混合菌株固态发酵玉米皮生产饲料蛋白，张博润等8利用白地霉Z-4、热带假丝酵母Z-14和木素木霉Z-203株菌混合发酵白酒糟生产饲料蛋白，但这些产纤维素酶的微生物大多数是真菌，而酵母菌与其相比更具有色、香、味和较高的蛋白质含量，可达60%；而且其适口性好，发酵过程中耐酸能力强，适宜于低 pH 培养，不易污染，回收率高，这些优点均是生产微生物蛋白饲料作为首选菌种的重要原因9。因此，若能利用酵母菌将玉米皮转化为优质饲料，则不仅解决

24、了玉米皮的利用问题，而且解决了饲料工业的问题10。同时将玉米皮做成饲料使其批量生产，也符合内蒙古大量开发农副产品的发展方向。玉米皮中主要成分会因玉米品种、质量、产地以及生产淀粉工艺条件的不同而略有差异。一般含有10%20%的淀粉、30%50%的半纤维素、10%20%的纤维素以及少量的蛋白质，几乎不含木质素11。1 材料与方法：1.1 实验原料玉米皮购于内蒙古阜丰科技有限责任公司，其他化学试剂购于国药集团化学试剂有限公司。1.2 菌种实验中用到的是毕赤酵母菌，为本实验室前期筛选得到的最佳菌种。1.3 实验方法1.3.1 玉米皮成分的测定1、 纤维素、半纤维素含量的测定方法：范式测定纤维含量法12

25、。2、 木质素含量的测定：饲料中酸性洗涤木质素的国标测定方法13。3、 粗蛋白含量的测定：饲料中粗蛋白的国标测定方法14。4、 淀粉含量的测定：测淀粉含量的国标方法酶水解法15。5、 脂肪含量的测定：测脂肪含量的国标方法索氏提取法16，以及酸水解法17。1.3.2酵母菌发酵玉米皮制备饲料蛋白1、培养条件对菌种浓度的影响在培养过程中，主要是以玉米皮为底物。 具体培养方法：厌氧培养需取24个30mL西林瓶，称取0.6g玉米皮，加入30mL蒸馏水；好氧培养需取24个100mL三角瓶（提前洗净，烘干），均称取0.6g玉米皮，加入30mL蒸馏水，盖胶塞，压铝盖后放入1.5MPa，121压力锅中灭菌。在操

26、作前，需先在超净工作台内杀菌30min，之后再在超净工作台内接入1.5mL酵母菌液（5%接菌量），置于25，150r/min的培养箱内培养菌种。每24个瓶培养一个时间梯度，分别为24h和48h。观察不同培养时间和需氧情况对毕赤酵母菌体的影响。2、蛋白胨添加量对菌种浓度的影响 实验过程同上述实验方法，只将蛋白胨做不同浓度梯度，添加量分别为：0g、1g、2g和3g。3、微生物饲料中菌体浓度测定 分光光度法： 将培养好的菌液先置于振荡器上振荡5min，使菌落脱离玉米皮。再将菌液倒入离心管中，置于3000r/min的离心机内离心5min18。然后取上清液倒入比色皿中，置于分光光度计内，将波长调至560

27、nm进行测定，测定OD560。血球板计数法： 由于原菌液浓度太大，给计数带来极大不便，故需预先稀释。本次所采用的稀释方法为：准备数个装有9mL蒸馏水30mL西林瓶，取1mL菌液添加到一个西林瓶中，此时该西林瓶中的菌液已是被稀释到10-1的菌液，稀释到几倍，就继续上述操作几次。起初准备每个样稀释到10-5，考虑到在操作过程中容易染菌，所以使用压过盖的西林瓶稀释，然后再利用血球板计数的方法计数19。1.3.3乙醇产量的测定高效液相色谱 Water 1515；色谱柱：Aminex HPX-87H（300mm x 7.8mm id，9m）；RI示差检测器；流动相：8mmol/lL H2SO4；进样体积

28、：20L；流动相流速：0.5ml/min；柱温：40。流动相配制 流动相：先用抽滤瓶抽取少量二次水，清洗抽滤瓶内壁，将清洗后的水倒出。再用抽滤瓶抽取约1000mL二次水后，再用超声波清洗器超声半小时，之后将其内的屈臣氏水加入到仪器储液瓶中。标准样品的配置： 乙醇标样：乙醇2g，72%的硫酸溶液5ml，最后用二次水稀释到1L。样品溶液的配制 从每个培养好的菌液中取上清液950L和50L的10%的硫酸溶液加入到离心管中，置于4,15000r/min的冷冻离心机内离心3min。之后取出上清液置于另一离心管中，在上述同样的条件下再离心3min，同样取出上清液经0.22m水相过滤头过滤后置于进样瓶中，开

29、始测样。2 结果与分析2.1 玉米皮组分的分析 通过以上实验表明：在玉米皮中，纤维素含量约为24.80 %、半纤维素含量为47.68 %、蛋白质含量为11.49 %、淀粉含量为15.50 %、脂肪含量为2.73% 以及木质素含量为5.41%。这与Palmarola-Adrados等20人的研究近乎相同。表2-1 玉米皮组成组成含量（%）蛋白质11.49淀粉15.50半纤维素47.68纤维素16.40木质素5.41脂肪2.732.2酵母菌发酵玉米皮制备饲料蛋白2.2.1 培养条件对菌种浓度的影响表2-2 培养条件对菌体浓度的影响 培养时间 OD560厌氧好氧0h0.74370.00100.743

30、70.001024h1.42860.00111.34440.001248h1.65850.00041.35260.0005 经显微镜直接计数法表明：厌氧条件下培养48h时，毕赤酵母菌体个数为2.31107个，相较于其他培养条件下，菌体浓度最高，见图2-2。图2-1 不同条件对菌种浓度的影响2.2.2 蛋白胨添加量对菌种浓度的影响表2-3 蛋白胨添加量对菌种浓度的影响蛋白胨添加量0g1g2g3gOD5601.6585+0.00041.3269+0.00051.5786+0.00031.4723+0.0005 经显微镜直接计数法表明：蛋白胨添加量为0g时，毕赤酵母菌体数量为2.31107/mL 个

31、，高于其他条件下培养的菌体数量，见图2-3。2.2.3 纤维素与半纤维素降解率的测定通过以上实验结果得知，在以玉米皮为底物时，厌氧培养48h以后的菌液浓度明显高于24h的菌体浓度，厌氧条件下比好氧条件菌体浓度高，所以对该条件下培养后的剩余培养基中的纤维素和半纤维素成分进行测定，得到如下结果：表2-4 纤维素和半纤维降解率组分半纤维素纤维素降解率（%）29.8437.93由计算结果可见，经过微生物发酵，玉米皮中纤维素含量由16.40%变到6.22%，半纤维素含量由47.68%变到33.45%，这说明毕赤酵母菌使玉米皮中的纤维素和半纤维素得以降解，供己所需，这可能是由于毕赤酵母菌产生某种可降解纤维

32、素的酶。随着营养成分的不断增加，菌体浓度也会随之上升，同时也印证了培养48h要比24h更旺盛的结论。2.2.4 乙醇产量的测定 经高效液相色谱测定后，得到并无乙醇产生。3 讨论Javed等21研究发现玉米皮中含有丰富的纤维类物质，其中包括有30%50%的半纤维、10%20%纤维素以及微量的木质素。本实验表明，玉米皮中的纤维类物质含量很高，其中纤维素含量16.40%，木质素含量为5.41%，而半纤维素含量高达47.68%，淀粉含量为15.50%、蛋白质含量为11.49%，在测量时会因原料的产地及种类不同略有差异。并且，毕赤酵母菌可以有效的利用玉米皮，通过显微镜直接计数法和分光光度法均证实：在以玉

33、米皮为底物时，厌氧培养48h以后的菌液浓度明显高于24h的菌体浓度，厌氧条件下比好氧条件菌体浓度高，这一现象可能是由于在起初接入毕赤酵母菌时，首先会利用一部分木糖维持，以致培养前期酵母处于延迟期生长较缓慢，菌体数目不明显增加，同时木糖的消耗较少9；培养后期酵母处于指数生长期，酵母数急剧增加，同时开始消耗玉米皮中的纤维素，这还有待后续研究探索。并且对剩余培养基成分进行测定，玉米皮中纤维素含量由 16.40%降到 6.22%，半纤维素含量由47.68%降到33.45%，远高于乔君毅22研究的纤维素和半纤维素的降解率分别为29.01 %和12.90 %的水平，达到了玉米皮成分得以转化的预期效果，在发

34、酵过程中并未产生任何乙醇等影响饲料生产的有毒物质，符合其作为微生物饲料的基本要求。参考文献 (References)1 史建国.基于SPCE061A型单片机的食品螺杆膨化机温度的检测与控制D.济南：山东大学, 2007. 2 丁声俊. 发展玉米深加工业应掌握适度J. 粮食与食品工业, 2011, 18(4):1-4. 3 WuYV, Norton RA. Enriehment of Protein,starch,fat,and sterol ferulates from corn fiber by finegrinding and air elassifieation J. Industria

35、l Crops and Produets, 2001, 14(2):135-13. 4 Mendona S, Grossmann M V E, Verh R. Corn Bran as a Fibre Source in Expanded Snacks J. LWT - Food Science and Technology, 2000, 33(1):2-8.5 Holguin-Acuna A. L. , Carvajal-Millan E. , Santana-Rodriguez V. , et al. Maize bran/oat flour extruded breakfast cereal: A novel source of complex polysaccharides and an antioxidant J. Food Chemistry, 2008