人上皮细胞黏附分子融合蛋白真核表达载体的构建,表达及初步鉴定

1、论著文章编号:1007-8738(200406-0765-04人上皮细胞黏附分子融合蛋白真核表达载体的构建、表达及初步鉴定王春艳1,谢鑫1,宋朝君1,金镇勋2,欧阳为明1,金伯泉13(1第四军医大学免疫学教研室,陕西西安710032;2解放军第465医院呼吸内科,吉林吉林132013收稿日期:2004-06-11;修回日期:2004-08-31基金项目:国家重点基础研究发展规划(973资助项目(N o.2001C B510004作者简介:王春艳(1974-,女,吉林省吉林市人,硕士生.3C orresponding authorConstruction and expression of hu

2、man EpCAM eukaryotic expression vectors and identification of their productsWANG Chun 2yan 1,XIE Xin 1,SONG Chao 2jun 1,JINZhen 2xun 2,OUY ANG Wei 2ming 1,JIN Bo 2quan131Department of Immunology ,F ourth Military Medical University ,X i an 710032;2Department of Respiration ,P LA 465th H ospital ,Jil

3、in 132013,ChinaAbstractAIM :T o construct EpCAM eukaryotic expre ssion vectors pIg 2EpCAM and p EGFP 2EpCAM and to expre ss them in COS 7cells.METH ODS :EpCAM cDNA wa s amplified by PCR and then inserted into the pIg and p EGFP vectors re spectively to construct recombinant vectors pIg 2EpCAM and p

4、EGFP 2EpCAM.The two recombinant vectors were transfected into COS 7cells under the mediation of lipo some.The expre ssed EpCAM 2Ig fu 2sion protein wa s detected by We stern blot.The expre ssion of EpCAM 2GFP fusion protein wa s observed under fluore scence micro scope.RESU LTS :DNA sequencing demon

5、strated that EpCAM wa s correctly cloned into the two vectors.The culture supernatant of the pIg 2EpCAM 2transfected COS7cells could bind effectively to mAb against human Ig G Fc.G reen fluore s 2cence distributed evenly in the cytopla sm and nuclei of p EGFP 2transfected COS7cells ,wherea s in p EG

6、FP 2EpCAM transfected COS7cells ,green fluore scence distributed mainly on the sur 2face of the cells.CONC L USION :Two EpCAM eukaryotic ex 2pre ssion vectors have been constructed and expre ssed succe ss 2fully ,which lays the foundation for functional re search of EpCAM and for preparation of mAb

7、to EpCAM.K eyw ords :epithelial cell adhe sion molecule ;eukaryotic expre s 2sion ;enhanced green fluore scence protein摘要目的:构建pIg 2E pC AM 及pEG FP 2E pC AM 真核表达载体,并在C OS7细胞中表达。方法:用PCR 扩增E pC AM cDNA ,酶切后分别与pIg 及pEG FP 两种载体连接,用脂质体法转染C OS7细胞。用免疫沉淀法检测pIg 2E pC AM 的表达产物;用荧光显微镜观察E pC AM 2G FP 的表达。结果:DNA

8、序列测定的结果显示,pIg 2E pC AM 及pEG FP 2E pC AM 载体的构建正确。免疫沉淀的结果显示,转染pIg 2E pC AM 的C OS7细胞的培养上清中含有相对分子质量(M r 为65000的融合蛋白,该蛋白与抗人IgGFc 段的mAb 具有良好的免疫反应性。荧光显微镜观察可见,转染空载体pEG FP 的C OS7细胞中绿色荧光均匀地分布于胞质和胞核;而转染pEG FP 2E pC AM 的C OS7细胞中绿色荧光主要分布于细胞表面。结论:成功地构建了两种E pC AM 的真核表达载体,并在C OS7细胞中表达,为E pC AM 的功能研究创造了条件,并为制备抗E pC

9、AM 的mAb 提供了免疫原。关键词:上皮细胞黏附分子;真核表达;增强型绿色荧光蛋白中图分类号:R392.12文献标识码:A人上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion m olecule ,E pC AM ,又称G A733、MH99、AUA1、M OC31和323/A3等,是一种M r 为40000的糖蛋白,表达于上皮来源的细胞表面,在大部分上皮源性癌组织中其表达水平明显升高1-3。E pC AM 可介导Ca 2+非依赖性同源细胞2细胞间的黏附。体内E pC AM的表达与上皮增生有关,与细胞的分化呈负相关4。抗E pC AM 的低亲和力mAb 作为某些肿瘤术后的辅助

10、治疗,可使Duke s C 型结肠癌患者7年的生存率增加30%,使残留癌灶降到最小5。此外,E pC AM 可被用作区别上皮源性肿瘤与非上皮源性肿瘤的标志蛋白6。目前,在德国已批准将抗E pC AM 的mAb 1721A 用于临床,其他多个国家尚处于临床试验阶段7。为了进一步探讨高表达人E pC AM 细胞的生物学行为的改变,以及为制备抗E pC AM 的mAb 提供抗原,我们分别构建了E pC AM 真核表达载体pIg 2E p 2C AM 及pEG FP 2E pC AM ,并成功地在哺乳动物细胞C OS7中表达。1材料和方法1.1材料C OS7细胞由本室保存。pIg真核表达载体由英国牛津

11、大学分子医学研究所惠赠。pEG FP2N1购自Clontech公司。PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。高保真DNA聚合酶Pyrobest及DNA快速纯化试剂盒及连接试剂盒,均购自T aK aRa 公司。大肠杆菌株DH5和MC1061由本室冻存。脂质体(Lipofectamine T M2000购自Invitrogen公司。Pro2 tein A2Sepherose4B购自R oche公司。抗人IgG Fc段mAb WT27由本室制备9。HRP2RAM IgG购自DAK O 公司。免疫印迹化学发光底物购自R oche公司。1.2方法E pC AM以备瞬时转染。2结果2.1pIg2Ep

12、CAM真核表达载体的构建以E pC AM cDNA为模板,用PCR扩增E pC AM胞膜外区cDNA,大小为864bp(图1a。将其克隆入pIg表达载体后以Hin d和P st进行双酶切鉴定,得到目的基因和载体两条酶切片段,分别与E pC AM胞膜外区cDNA和载体pIg大小相符(图1b。测序结果与G enBank中对应的序列相一致 。图1pIg2E pC AM真核表达载体的构建Fig1Identification of eukary otic expression vector pIg2E pC AMM:D L2000D N A m arker;a:Am plification of ext

13、racellular region of E pC A M cD2 N A by PCR;b:Restriction enzyme digestion analysis of positive clone.2.2pIg 2EpCAM 表达产物的鉴定以pIg 2E pC AM 瞬 时转染C OS7细胞。取细胞培养上清经免疫沉淀后,进行S DS 2PAGE 显示,表达产物为融合蛋白,其相对分子质量(M r 为65000,同预期的大小一致。免疫印迹的结果显示,表达产物与抗人IgG Fc mAb 具有良好的反应性(图2。 图2pIg 2E pC AM 表达产物的鉴定Fig 2Identificatio

14、n of the expressed product of pIg 2E pC AMM:Protein marker ;1:S DS 2PAGE analysis of the expressed E pCAM;2:W est 2ern blot analysis of the expressed E pCAM.2.3pEGFP 2EpCAM 表达载体的鉴定以E pC AM cDNA 为模板进行PCR ,扩增出大小为942bp 的全长cDNA 片段(图3a 。将其克隆入pEG FP 表达载体后转化大肠杆菌DH5株,从阳性菌落提取的质粒用Hin d 和P st 进行双酶切鉴定,得到目的基因和载体

15、两条酶切片段,分别与E pC AM 全长cDNA 和载体pEG FP 的大小相符(图3b 。测序结果与G enBank 中对应的序列相一致。 图3pEG FP 2E pC AM 真核表达载体的构建F ig 3C onstruction of eukary otic ex pression vector pEG FP 2E pC A MM:D L 2000DNA marker ;a :Am plification of E pCAM cDNA by PCR ;b :Restriction enzyme digestion analysis of positive clone.2.4pEGFP 2

16、EpCAM 转染细胞的荧光分布用pEG FP 2E pC AM 和空载体pEG FP 分别瞬时转染C OS7细胞后,在荧光显微镜下可见,pEG FP 转染C OS7细胞后绿色荧光均匀地分布于整个细胞(图4A ;而pEG FP 2E pC AM 转染C OS7后绿色荧光集中分布于细胞膜表面(图4B 。图4pEG FP 和pEG FP 2E pC AM 转染C OS7细胞的荧光显微镜观察Fig 4The observation of C OS7cells trans fected with pEG FP andpEG FP 2E pC AM vectors under fluorescence m

17、icroscope (×200A :pEG FP trans fected C OS 7cells ;B :pEG FP 2E pC A M trans fected C OS 7cells.3讨论目前,大多数用于治疗的抗肿瘤的mAb 主要是针对肿瘤细胞膜抗原的。E pC AM 表达于大部分上皮来源的细胞上2,由于其在上皮源性癌组织的表达水平明显升高3,因此,可作为肿瘤免疫治疗的候选靶分子。用抗E pC AM 的mAb 作为辅助治疗已获得确切疗效,如对进行了根治手术同时用edrecolomab (抗E pC AM mAb 加以辅助治疗的Duke s C 期结肠癌患者,经过7年跟踪调查

18、发现,死亡率降低了32%,复发率减少了23%5,而且其毒副作用要明显小于传统的放疗和化疗。目前,E pC AM 相应的配体(或受体尚未鉴定,表达膜型E pC AM 的转染细胞将有助于E pC AM 相应配体(或受体的鉴定,从而促进对其分子结构和功能的研究。E pC AM 分子的N 端富含半胱氨酸,可组成多对链内的二硫键,其结构十分复杂。与原核表达系统相比较,真核表达产物可能更接近于天然分子的构象。因此,我们在以往原核表达的基础上构建了E pC AM 基因的真核表达载体pIg 2E pC AM 及pEG FP 2E pC AM 。经鉴定,它们可分别表达可溶型和膜型E pC AM 分子。免疫沉淀检

19、测表明,pIg 2E pC AM 的真核表达产物具有良好的免疫反应性。PEG FP 2E pC AM 转染C OS7细胞后,其绿色荧光集中表达于细胞膜上,而转染空载体pEG FP 的C OS7细胞,其绿色荧光均匀表达于细胞质和胞核。此结果为下一步E pC AM 的基础和临床研究创造了有利的条件。参考文献:1Herlyn M ,S teplewski Z ,Herlyn D ,et al .C olorectal carcinoma 2specific antigen :detection by means of m onoclonal antibodiesJ .Proc Natl AcadSc

20、i USA ,1979,76:1438-1446.2M omburg F ,M oldenhauer G,H mmerling G J ,et al .Immunohistochemicalstudy of the expression of a M r 34000human epithelium 2specific surface glycoprotein in normal and malignant tissuesJ .Cancer Res ,1987,47:2883-2891.3W ent PT ,Lugli A ,M eier S ,et al .Frequent E pC AM p

21、rotein ex pression in human carcinomasJ .Hum Pathol ,2004,35(1:122-128.4Schiechl H ,D ohr G,Eherer A.Immunohistochemical localization andcharacterization of a protein from the bas olateral membrane of rat small in 2testine epithelium using m onoclonal antibody G Z 21J .J Histochem Cy 2tochem ,1986,3

22、4:1659-1665.5Riethm üller G,H olz E ,Schlim ok G,et al .M onoclonal antibody therapyfor resected Dukes C colorectal cancer :seven 2year outcome of a multicen 2ter randomized trial J .J Clin Oncol ,1998,16:1788-1794.6T ellechea O ,Reis JP ,D omingues JC ,et al .M onoclonal antibody BerEP4disting

23、uishes basal 2cell carcinoma from squam ous 2cell carcinoma of the skinJ .Am J Dermatopathol ,1993,15:452-455.7Riethm üller G,Schneider 2G dicke E ,Schlim ok G,et al .Randomisedtrail of m onoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes C col 2orectal carcinomaJ .Lancet ,1994,343:1177-

24、1183.8M ellstedt H ,Frodin J E ,M asucci G,et al .The therapeutic use of m ono 2clonal antibodies in colorectal carcinomaJ .Semin Oncol ,1991,18(5:462-477.9户义,刘雪松,朱勇,等.抗Ig 融合蛋白FC 段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究J .细胞与分子免疫学杂志,2003,19(2:170-172.(上接764页M r 约为60000处有明显的新生蛋白表达带出现(图1,大小与hBit1融合蛋白相符,而诱导的空载体菌则无此带.通过凝胶薄层扫描

25、分析,大肠杆菌中hBit1融合蛋白的表达产物占全菌总蛋白量的40%。 图1hBit1融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达的聚丙烯酰氨凝胶电泳M:Low m olecular weight protein marker ;1:N on induced bacteria bearing pG EX 24T 3;2:Induced bacteria bearing pG EX 24T 3;3:N on induced bacteria bearing pG EX 24T 32Bit1;4:Induced bacteria bearing pG EX 24T 32Bit1.2.2抗血清的特异性鉴定将制备的兔抗

26、hBit1抗血清作Western blot 分析,检查大肠杆菌中表达的hBit1融合蛋白。结果表明,与IPTG 诱导后的全菌蛋白作用时,在M r 约60000处有明显的显色印迹(如箭头所示,同时也有非特异的显色条带(图2A ;用非特异性去除法纯化的抗血清再与IPTG 诱导后的全菌蛋白作用时,在M r 约60000处仍然有明显的显色印迹(如箭头所示,大小与hBit1融合蛋白相符(图2B ,而非特异的显色条带明显减少。3讨论bit 1基因在原核和真核生物中保守存在,并与凋亡发生有关。Bit1从线粒体中释放至细胞质中以后,可以与AES 结合,从而引起不依赖于caspase 的细胞凋亡。胞质内Bit1浓度的升高可以明显促进anoikis 的发生,而其浓度的下降可以降低a