猪瘟重组疫苗的研究进展.docx

1、猪瘟重组疫苗的研究进展袁远，杨文辉(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所.黑龙江哈尔滨150001；2.哈尔滨北方森林动物园动物医院，黑龙江哈尔滨】50300)摘要：猪瘟是严重危害养猪业一种重要传染病.弱毒疫苗的应用一定程度地控制了该病的流行与发生.但仍存在一些缺陷，新型、高效、标记疫苗的研制一直以来成为猪瘟疫苗领域的研究热点。本文对猪瘟重组疫苗领域取得的研究研究进展进行了综述。关键词：猪瘟病毒；疫苗；中和抗体；T细胞反应中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：0529-5130(2008)09-0100-05猪瘟(classicalswinefever,CSF)被OIE认定为烈性传染

2、性疾病之一。它能感染家猪和野猪，从经济学和卫生学的角度来看，CSF已成为对全球养猪业造成毁灭性损失的疾病之一。正如很多其他的疾病能够采用疫苗免疫一样，50多年前研制的弱毒活疫苗是目前针对猪瘟病毒(CSFV)的最有效的疫苗。虽然该弱毒活疫苗具有很高的保护率，但还是存在一些缺陷。如免疫接种的致弱活病毒诱导机体产生的抗体与野毒感染动物后产生的抗体类型相似,使免疫动物和野毒感染的动物难以区分。最近，标记疫苗以及能区分野毒感染和疫苗接种(DIVA)的疫苗的研究成功打破了这种窘境。随着诊断手段与工具的改进，尽管人们在新型和更安全的标记疫苗研制方面做了不少努力，但是猪瘟疫苗的研制仍需进一步加强。本文对当前猪

3、瘟疫苗研究领域的一些相关进展进行了综述。1猪感染CSFV诱导的免疫反应了解CSFV与猪免疫系统之间的相互作用及其在致病机制中的功能是设计新的抗病毒策略的关键点。几十年前的研究成果表明CSFV具有破坏淋巴样滤泡的能力，且感染的主要靶细胞是单核巨噬细胞系的骨髓细胞(SWC3*；SWC8-)。有趣的是，虽然CSFV不易感染成熟的粒性白细胞(SWC3；SWC8)，但却能感染未完全分化的骨髓祖细胞(SWC3、；SWC8-),从而解释了CSFV出现在外周血成熟的SWC8*细胞的原因。和其他严重的出血性疾病一样，CSFV也可感染内皮细胞，对这些细胞病理损伤在CSFV发病中似乎发挥关键的作用，各种CSFV发病

4、的临床症状中以微血栓、弥散性血管内凝固和纤维蛋白溶解最为典型。虽然CSFV感染内皮细胞能抑收稿日期：2008-03-26作者简介：袁远(1972-).男，助理研究员。制干扰素和细胞凋亡的产生，但也能诱导炎性细胞因子的产生。CSFV利用巨噬细胞和树突状细胞(DCs)的迁移能力弥散全身。在感染细胞内的抗凋亡途径的激活能确保病毒的存活，而可溶性促炎症反应细胞因子的表达诱导并促进了感染细胞周围的健康细胞的凋亡，因而逃避了对感染细胞的识别。最近的研究结果表明CSFV不仅能通过分泌细胞因子,还能通过其他机制来诱导免疫抑制，如表达CSFV结构蛋白Ems蛋白，该蛋白在体外对T淋巴细胞已显示毒性作用。CSFV也

5、能激活T细胞分泌细胞因子,如IL-10,该细胞因子可能在CSF感染后的免疫抑制中起关键作用。鉴于CSFV逃避免疫反应的能力，我们必须制定控制感染和阻止CSFV介导免疫逃避的免疫策略。如上所述，CSF是一种以高死亡率为特征的毁灭性疾病，依据毒株毒力和感染猪群的免疫状况的差异，感染所造成的显著免疫抑制能够在机体的免疫系统被激活之前较早的导致一部分感染动物的死亡；而一些动物能借助自身的保护性免疫反应抵抗病毒的感染，从而对后来的再感染产生保护作用，以保护其他动物群体)。在某些情况下，免疫反应不足以把CSFV从动物体内清除，导致CSFV在宿主体内能够持续存在，在有中和抗体存在的情况下能建立慢性感染；反之

6、，先天感染CSFV能导致动物的持续感染，但其不能产生特异性抗体，这可能是在胎儿的淋巴细胞分化期间产生免疫耐受的结果。CSFV在动物体内的持续存在及诱导的慢性感染，对我们进一步弄清病毒与免疫细胞的相互作用机理以及哪些特异性免疫反应是具有保护功能有一定的作用。最新研究表明，CSFV感染后721d,甚至在中和抗体产生之前，感染猪就能诱导产生特异性CD4*T细胞和毒性T淋巴细胞(CTL),这种特异性的CTLs主要识别CSFV的结构性E2蛋白和非结构性NS3蛋白，这些结果和先前的发现即在NS3和NS4病毒蛋白之间具有一个CTL表位是一致的。有研究表明猪的一些白细胞抗原（SLA）I型和II型肽，其中大部分

7、锚定NS3多肽和结构性E2蛋白。因此，感染动物持续散毒是新的CSF爆发的潜在源头，而且对疾病的诊断带来了新的挑战。2抗CSFV的疫苗策略CSFV的经典疫苗尽管早期的CSFV灭活疫苗不能有效地抵抗病毒感染,但是CSFV弱毒疫苗已被证实能有效预防猪瘟的发生1成。第一次用兔化弱毒疫苗接种试验是60多年前进行的，至今这个领域的进展并不十分明显。CSFV弱毒疫苗不但安全，而且即使怀孕母猪，在免疫5d后也能产生高水平的中和抗体，并对猪瘟强毒的攻击提供保护，在CSF仍然流行的地区，应用弱毒疫苗仍然是控制该病的重要措施之一。CSFV弱毒株介导的免疫保护机制尚未完全清楚。在中和抗体产生之前，免疫动物就获得了保护

8、，这一点已经被证实。在免疫接种C株CSFV后的第12天就能检测到抗体，在2884d内到达高峰。猪群在一次免疫后产生的抗体有可能使其获得终身保护3）。中和抗体在对CSFV免疫保护中和具有重要作用，而一些研究表明抗体滴度和免疫保护之间没有必然联系，因此除抗体以外的一些免疫反应可能对动物的免疫保护也起着重要作用。一般情况下，中和抗体能保护动物免受病毒攻击，但免疫接种后，在缺少中和抗体的情况下也能产生保护作用。尽管CSFV弱毒疫苗经过证实能产生有效保护，但仍然存在一些缺陷。疫苗接种产生的抗体和自然感染诱导的抗体很难区分，这不利于鉴别诊断刃。而且疫苗保存和使用不当以及疫苗免疫不能覆盖所有易感猪群，均会导

9、致免疫失败。此外，弱毒活毒苗在接种后至少15d内能够在淋巴器官（主要是扁桃体）内一定程度的复制，这期间利用标准的诊断方法难以将其与野毒区分开来CSFV的新型疫苗像许多其它病毒一样，感染性克隆平台的建立与应用为深入了解病毒的复制机制及致病性提供了新的机遇猪瘟病毒弱毒C株、Alfort/Tubigen.Eystrup和Brescia株感染性克隆的建立使我们明确了Ems.Npro及E2蛋白为CSFV的潜在毒力决定因子I8-,9ioCSFV反向遗传学的信息进一步确认了促进该病毒的蛋白或决定病毒毒力和宿主范围的蛋白域。且为CSF新型疫苗设计与研制带来了更多的思路与策略。毒力强的CSFV在特定的流行病学条

10、件下能演化成毒力较弱的毒株，这为研究决定病毒毒力的基因组变异，尤其是E2基因的变异提供了新的途径【狈。这一技术使我们制造缺失E2或Ems基因的突变病毒株成为可能。这种缺失突变株只能在能反式提供缺失蛋白的感受态细胞系上生长，因此将其作为疫苗是安全的。一旦接种到体内，这些突变病毒能诱导较强的免疫反应而不产生新的子代病毒，相似的策略已经应用到几种通过交换来自CSFV弱毒C株和抗原性相关痕病毒的E2或Ems基因而构建的嵌合体中、最后，因病毒复制子颗粒不具有传播能力而逐渐成为安全性疫苗的一种选择N】。为了更加有效,这类疫苗的构建应包含大部分已知能够诱导CSFV细胞和体液免疫保护性决定簇的E2糖蛋白。对于

11、这类疫苗，一个值得关注的焦点是突变疫苗株和CSFV野毒株之间发生重组的可能性一些用来研制CSFV的DIVA疫苗的策略如通过减少病毒在动物体内的复制或避免病毒的胎盘传播，已被证实其效果良好。这类疫苗在构建过程中大部分包括全长CSFVE2糖蛋白或这个蛋白的片段。E2蛋白已经在不同的病毒载体中获得表达，如痘苗病毒和腺病毒表达载体，或种属特异性载体，如猪痘病毒或伪狂犬病病毒。上述研究结果表明，应用这些载体病毒构建的重组病毒在临床上都能够诱导有效的免疫保护？-习。牛病毒性腹泻病毒是CSFV的抗原相关病毒，曾被用作载体表达CSFVE2蛋白，能够诱导免疫保护来抵御病毒的攻击。尽管这些疫苗具有保护性潜力，但是

12、根据病毒传播和CSFV的胎盘传播情况，弄清楚它们诱导的免疫反应和保护效率，仍有很多研究工作有待开展2.3亚单位疫苗为了满足更新更安全的控制CSF标记疫苗的需要，已经采用了一些用来研制DIVA疫苗和开展辅助型诊断试验的方法。至今，最有效的CSF的亚单位疫苗也是基于CSFV主要E2慵蛋白而研制的。利用杆状病毒系统表达E2糖蛋白的不同节段获得一系列的重组E2蛋白，并经证实存在不同程度的保护作用。其中免疫原性最强的一个为表达缺少跨膜域重组E2糖蛋白，该重组蛋白易于从杆状病毒感染细胞上清中分泌和纯化出来迄今为止，大部分的CSFVE2亚单位标记疫苗还处于试验阶段，只有两个疫苗被欧洲医疗产品评估机构（EME

13、A）批准并商品化。这类疫苗免疫后动物仅仅产生抗E2糖蛋白的特异性抗体，而野毒感染的猪却同时能够产生抗Ems蛋白的抗体，这两种抗体利用现有的ELISA抗体检测方法能够加以区分，但是其保护效率还有待于进一步的评估:割。与经典的弱毒疫苗相比，尽管亚单位疫苗具有很多优势，但其保护效率还非常有限，尤其对怀孕母猪更是如此，且造成持续感染动物个体存在的风险很大最后两个原因都与缺少有效的鉴别诊断方法相关，导致了在自然感染情况下，这些疫苗策略作为紧急措施不能推广应用。首先，抗Ems蛋白的特异性抗体直到感染CSFV野毒株后2142d才产生（需要依据毒株毒力），这使得在疾病早期的鉴别诊断变得困难；其次，现有的基于E

14、蛋白的远不如基于E2蛋白的EUSA检测方法敏感和特异）。利用杆状病毒表达系统，已使得开展E2慵蛋白的保护域进一步得到定义，探索E2蛋白保护性表位的某些特征成为可能列。所有这些研究，将允许在新的疫苗构建中添加中和性B细胞表位，以利于对免疫动物和CSFV感染动物的鉴别诊断。在研制新型和改进CSF疫苗的同时，应致力于研发能区分免疫个体和感染个体的诊断新方法。不幸的是，相比于其他的疾病，商业利益的驱使可能是新型、有效CSFV诊断方法和疫苗研发滞后的主要原因。基于E2蛋白的疫苗显示出类似存在基于其他策略的CSF疫苗中的一些限制。有些疫苗免疫动物不产生针对CSFV特异性抗体，而且保护效果和诱导的中和抗体之

15、间不是完全相关。对于能介导针对CSFV的高水平保护的新的DIVA疫苗的研究，应该探索出新的诊断手段作为补充叫2.4DNA疫苗DNA免疫是近十年发展起来的最为有前途的一种疫苗策略，这类疫苗能同时诱导细胞免疫和体液免疫，易于生产，并且被证明是安全的，即使是接种含有母源抗体的新生个体也是相当安全的J。由于它的单一性，DNA疫苗易于设计，且有可能将所表达的靶蛋白通过指定途径导入机体内，因此，DNA免疫将对理解针对某特定病原内在的保护性免疫机制和免疫保护决定簇精确定位将是一个有价值的技术手段。大部分CSFV的DNA疫苗是基于病毒的主要免疫原性决定簇，即来自不同病毒株系的E2糖蛋白的表达。一些人报道用DN

16、A疫苗编码全长E2搪蛋白，而也有人用缺少其跨膜域的突变形式）。由于所表达E2蛋白的形式、攻毒用CSFV毒株的毒力及剂所不同，不同研究小组开展的CSFVDNA疫苗的免疫效力试验结果也难以进行比较。尽管用编码整个E2糖蛋白的DNA疫苗大剂量进行免疫，临床上能保护免疫猪不发生CSF,且证实其保护效果与抗CSFV的中和抗体之间不存在直接联系。通过采用启动-加强免疫的免疫程序，即先接种DNA疫苗后免疫表达CSFVE2全长蛋白的重组腺病毒，也同样能获得同等水平的免疫保护效果用编码CSFV全长E2糖蛋白的DNA疫苗接种动物，在没有中和抗体产生的情况下也能提供保护效果，尽管免疫动物在CSFV攻毒之前检测不到抗

17、体,但在攻毒后第6d可检测到中和抗体，甚至一些免疫动物出现免疫反应增强现象。然而免疫动物却没有出现病毒血症，疫苗免疫提供了临床发病和免疫抑制的保护，与针对中和抗体的诱导和MHCII限制型细胞免疫相关。这一研究证明了免疫反应的其他分支，如MHCII限制型CD4*T细胞的诱导在抗CSFV保护方面可能起到一定的作用*坨。3小结与展望CSFV的疫苗设计是多样的，使得我们难以确认哪一种是最好的选择。在不同的研究中，疫苗剂鼠、免疫次数、免疫途径、免疫攻毒之间的时间间隔均不相同，攻毒用病毒的毒株、毒力、攻毒剂信与途径以及用来评估疫苗效果的标准也不相同。建立常规免疫和攻毒程序和追踪观察标准，这些对于不同疫苗类

18、型的客观对比和CSFV合理疫苗策略的选择都是非常必要的。CSFV主要感染抗原递呈细胞，如内皮细胞，巨噬细胞和DCs,且与此同时诱导周围的B细胞和T细胞的旁观者凋亡。致病力强的CSFV在体内能够演变成弱毒株，因此在病毒传播到周围动物之前大大避免了感染动物的死亡。通过用能编码CSFV全长E2糖蛋白的DNA疫苗免疫来模拟病毒感染，能有效诱导T细胞反应和中和抗体产生，提供对CSFV攻毒的完全保护。当评估猪瘟疫苗免疫效果的时候，除了检测体液免疫反应指标外，再引入一些其他的相关指标是可行的。在大部分已发表的CSFV疫苗研究中，尤其是那些经典弱毒活疫苗使用过程中，中和抗体的检测仅仅是所考虑的唯一指标。现有研

19、究结果表明T细胞反应在一定程度上能够抑制CSFV复制，在CSF的免疫保护中也是很重要的9Mo尽管分析T细胞免疫反应的技术，在大部分的诊断实验室都没有得到应用，因此我们应该努力研究开发基于细胞免疫衡量的新的诊断手段。通过ELISA、ELISPOT、淋巴增殖试验来检测免疫后或感染各种CSFV毒株后所诱导的细胞因子外形特征，在将来会成为有用的诊断技术手段。这些诊断技术的一个优势是它们能够在免疫后一个很短的时间内，甚至在抗体反应出现之前即可对动物的使免疫状态获得分析功。虽然在CSFV的有效重组疫苗研制过程中仍存在很多困难，但是最近在这一领域的研究进展，充分显示了此种疫苗广阔的应用前景。同时，抗CSFV

20、的保护性免疫原及保护机制渐渐被人们所确认，这也将有利于设计更加新颖、更加有效的猪瘟标记疫苗。参考文献：1MoennigV,Floegel-NiesmannG,Greixr-WilkeI.ClinicalsignaandepidemiologyofclAssicalswinefever：areviewofnewknowledgeJ.TheVeterinaryJournal,2003,165:11-20.2deSmitAJ.1laboratorydiagnosis,epizootiology,andefficacyomarkervaccine#inclassicalswinefever：arevi

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37、critiealRe.*仃唧III岫，牛肉嫩度营养调控技术研究郭万华I,谷子林2L魏昆鹦(1.河北农业大学动物科技学院.河北保定071001；2.河北农业大学山区研究所.河北保定071001)摘要：牛肉饿度是影响牛肉消使的最重要的因素之一，到目前为止通过非营养调控的方式来改善牛肉嫩度的方法已经比较成熟；随着营养调控技术研究的进一步发展，发现屠宰前适时改变日粮的组成可以提高牛肉嫩度。关键词：动物营养；牛肉嫩度；综述；调控中图分类号：S816.4文献标识四：A文章编号：0529-5130(2008)09-0104-03牛肉嫩度是影响牛肉消费的最重要的因素之一，并且嫩度是决定牛肉质陆的最重要的适口性

38、性状，因为它直接关系到消费者对牛肉口味的满意程度。美国每年因嫩度不合适造成的损失高达数亿美元，到目前为止通过非营养调控的方式来改善牛肉嫩度的方法已经比较成熟，例如：科学成熟处理、电剌激嫩化处理、外源蛋白酶嫩化处理，冷冻嫩化处理，嫩斩和吊挂处理，NaHC03或N*C()3嫩化处理、水震波嫩化处理，选种选育、适时屠宰等。不同的环境和营养条件对牛肉嫩度也有影响，但这种影响作用很小。随着营养调控技术研究的进一步发展，发现屠宰前适时补充维生素可以在一定程度上提高牛肉的嫩度。影响牛肉嫩度的因素很多，目前己得到证实的因素有品种、个体差异、性别、年龄、饲料，维生素D、E和维生素A等。本文从营养的角度对影响牛肉嫩度的因素进行综述。1维生素A对牛肉嫩度的影响维生素A是目前世界上最易缺乏的一种营养素，它的缺乏可损害机体免疫功能，影响机体的正常生长发育，并造成先天不同器官的畸变。然而对于维生素A与肉品质关系的研究报道目前非常少。万发春在研究维生素A对利鲁杂交陶牛牛肉品质的